(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210384617.2 (22)申请日 2022.04.13 (71)申请人 福建省农业科 学院畜牧兽医研究所 地址 350013 福建省福州市晋安区新店镇 埔垱100号 (72)发明人 陈翠腾　陈珍　朱春华　刘斌琼　 张世忠　蔡国漳　林琳　万春和　 黄瑜　江斌　 (74)专利代理 机构 福州创蔚来知识产权代理有 限公司 3 5290 专利代理师 郑艳艳 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种鸽轮状病毒A型环介导等 温扩增检测引 物组及其试剂盒 (57)摘要 本发明涉及一种鸽轮状病毒A型环介导等温 扩增检测引物组及试剂盒。 本发 明根据鸽轮状病 毒A型的VP6基因设计引物组： 外引物(PiRVA ‑F3 和PiRVA‑B3)、 内引物(PiRVA ‑FIP和PiRVA ‑BIP) 和环引物(PiRVA ‑LB)。 具体序列分别见SEQ  ID  NO.1‑5。 本发明根据所设计的引物组建立一种鸽 轮状病毒A型环介导等温扩增检测方法， 该检测 方法与鸽常见传染病病原不发生交叉反应。 本发 明的检测方法特异性强、 准确性好、 灵敏度高， 无 需昂贵仪器设备， 便于基层临床现场使用， 方便 快速。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图1页 CN 114854734 A 2022.08.05 CN 114854734 A 1.一种鸽轮状病毒A型环介导等温扩增检测引物组， 其特征在于： 所述的引物由1对外 引物PiRVA ‑F3和PiRVA ‑B3、 1对内引物PiRVA ‑FIP和PiRVA ‑BIP、 1条环引物PiRVA ‑LB组成， 上 述引物序列如下： PiRVA‑F3： 5’ ‑AAATCACGCA ACAGTCGG‑3’， PiRVA‑B3： 5’ ‑AGTTATCTTCTCTAGATGCTGA A‑3’， PiRVA‑FIP： 5’ ‑GACAAATATGGCTCATTTGCATCTG ‑CTGACACTA AAAATTGAATCCG‑3’， PiRVA‑BIP： 5’ ‑ACAGGTTTGAGACAG GAATACGC‑AATTATTAAGCAACTCAGTC CA‑3’， PiRVA‑LB： 5’ ‑GATTCCAGTAGGACCAGTATTTCC‑3’。 2.如权利要求1所述的鸽轮状病 毒A型环介导等温扩增检测引物 组在制备鸽轮状病 毒A 型检测试剂盒中的应用。 3.一种含权利要求1所述引物组的鸽轮 状病毒A型检测试剂盒。 4.如权利要求3所述的鸽轮状病 毒A型检测试剂 盒的环介导等温扩增检测方法， 其特征 在于： 其反应体系为20 μL， 且20 μL反应体系中包括： 溶解后的LAMP  OG Reagent 15 μL、 LAMP   Primer Mix 2 μL、 模板RNA或DNA  1 μL、 ddH2O 2 μL； 其中， LAMP  Primer Mix中各引物的浓度为： P iRVA‑FIP和PiRVA ‑BIP分别为8 μM、 PiRVA ‑ LB为4 μM、 PiRV A‑F3和PiRV A‑B3分别为1 μM； 环介导等温扩增检测方法的反应条件为： 6 3℃30min。 5.如权利要求1所述的鸽轮状病 毒A型环介导等温扩增检测引物 组在制备鸽轮状病 毒A 型快速诊断试剂中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854734 A 2一种鸽轮状病毒A型环 介导等温扩增检测引物组及其试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于禽病学检测领域， 具体涉及一种鸽轮状病毒A型环介导等温扩增检测 引物组及试剂盒。 背景技术 [0002]人类养鸽历史悠久， 鸽经驯化成观赏鸽、 赛鸽和肉鸽， 拥有较强的免疫系统， 加上 鸽舍多采用开放式或半开放式， 空气流通好， 空气新鲜， 相比较其他畜禽， 鸽生病较少。 然 而， 随着养 鸽业规模化、 集约化的迅速发展， 饲养总量、 饲养密度的增加， 鸽的饲养方式发生 了改变， 由于饲养管理水平低， 疫病防治意识差， 加上鸽的贸易流通频繁(包括信鸽的比 赛)， 鸽病也越来越多， 越来越严重， 越来越复杂。 近年来鸽病毒性传染病严重威胁着养鸽 业， 据国内外研究， 已经报道的鸽病毒性传染病有鸽新城疫、 鸽轮状病毒感染、 鸽腺病毒感 染、 鸽圆环病毒感染、 鸽疱疹病毒感染、 鸽痘和H9亚型低致病性 禽流感等。 [0003]轮状病毒(Rotavirus， RV)属于呼肠孤病毒科轮状病毒属， 病毒粒子无囊膜， 呈正 二十面体， 分3层壳体， 直径约75nm， 在电镜下呈车轮状， 由此得名。 轮状病毒基因组由11节 段双链RNA构成， 各段长663～3302bp。 根据国际病毒分类委员会(International   Committee on Taxonomy of Viruses， ICTV)的最新 分类， 轮状病毒属包 括A～J共10个病毒 种。 至今轮状病毒A型、 D型、 F型和G型均能感染禽类， 截至目前轮状病毒A型、 D型和G型均能 感染鸽子。 轮状病毒同一病毒种的不同宿主的毒株之间的基因序列往往差异明显。 轮状病 毒A型(Rotavirus  A， RVA)一般感染特定种群的动物， 此类病毒称为同源株， 但偶尔也存在 跨种传播现象。 轮状病毒A型宿主广泛， 广泛存在于哺乳动物和禽类， 禽类感染后临床症状 主要表现为严重腹泻、 脱水、 发育不良和死亡率增加。 鸽感染轮状病毒A型以呕吐、 腹泻、 脱 水和泄殖腔炎为特征。 病鸽在病初精神差， 食欲减退， 消化功能紊乱。 继而萎靡、 嗜睡、 不食 和剧烈腹泻， 粪便呈水样， 严重脱水， 体瘦， 贫血， 最后因衰竭而死亡。 剖检病变主要表现为 肝脏坏死和肠道黏膜充 血、 出血和水肿， 另外机体脱 水， 泄殖腔发炎。 轮状病毒A型感染已严 重影响了 养鸽业的健康发展。 [0004]病毒分子生物学检测主要有 常规PCR方法和实时荧光定量PC R方法， 但由于实验设 备要求比较高， 在基层的检验检疫部门推广应用难。 环介导等温扩增技术(loop ‑mediated   isothermal  amplification， LAMP)是应用4 ‑6条特异性引物， 通过Bst  DNA聚合酶， 对靶基 因进行的一种恒温扩增技术， 该技术具有扩增特异性强、 灵敏度高、 操作快速简便、 检测简 单等特点， 摆脱了对PCR仪、 实时荧光定量P CR仪等昂贵仪器的依赖， 在基层单位的检测更加 方便。 相对于 现有的其他核酸扩增技术， LAMP具有 许多独特的优点： ①LAMP检测技术扩增的 特异性很高， 其特异 性引物可以准确识别目的序列， 对靶序列具有高度的选择性， 减少了非 特异性的扩增。 ②LAMP技术可以在等 温条件下实现扩增， 减少了对昂贵、 精密实验仪器的要 求， 同时扩增效率高， 仅需要普通水浴锅调节温度(60℃～65℃)， 大大降低了检测的费用， 特别适合基层和现场使用。 ③LAMP检测技术在阳性扩增反应中会产生大量的双链DNA混合 物和白色焦 磷酸镁沉淀， 其扩增产 物有多种检测方法， 双链DNA产 物可以通过琼脂糖凝胶电说　明　书 1/4 页 3 CN 114854734 A 3