(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210384449.7 (22)申请日 2022.04.13 (71)申请人 河南师范大学 地址 453007 河南省新乡市 建设路东段46 号 (72)发明人 高武军　李书粉　张玉兰　邓传良　 李宁　 (74)专利代理 机构 北京方圆嘉 禾知识产权代理 有限公司 1 1385 专利代理师 朱玲艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6879(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种芦笋超雄株鉴定用分子标记组合、 引物 组、 试剂盒、 鉴定方法及应用 (57)摘要 本发明涉及一种芦笋超雄株鉴定用分子标 记组合、 引物组、 试剂盒、 鉴定方法及应用， 属于 植物分子遗传学技术领域。 本发 明提供了一种芦 笋超雄株鉴定用分子标记组合， 所述分子标记组 合包括芦笋Y染色体雄性特异 基因SOFF片段和芦 笋X染色体特异区基因WIP2/NTT片段。 检测本发 明所述分子标记组合可实现芦笋性别的预测， 尤 其是鉴别超雄株， 本发明为鉴定芦笋超雄株提供 了简便稳定的分子标记， 在 芦笋全雄分子标记辅 助育种方面具有重要应用价 值。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 114717354 A 2022.07.08 CN 114717354 A 1.一种芦笋超雄株鉴定用分子标记组合， 其特征在于， 所述分子标记组合包括芦笋Y染 色体雄性特异基因SOFF片段和芦笋X染色体特异区基因WIP2/NTT片段， 所述芦笋Y染色体雄 性特异基因SOFF片段的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示， 所述芦笋X染色体特异区基因 WIP2/NTT片段的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 2.一种芦笋超雄株鉴定用引物 组， 其特征在于， 所述引物 组包括扩增芦笋Y染色体雄性 特异基因SOFF片段的引物对YSMF和YSMR， 以及扩增芦笋X染色体特异区基因WIP2/NTT片段 的引物对XSMF和XSMR； 所述YSMF的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示， YSMR的核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示， XSMF的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示， XSMR的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.6所示。 3.一种芦笋超雄株鉴定用试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂 盒包括权利要求2所述的引物 组和反应试剂， 所述反应试剂包括2X  M5 Hiper超光速mixw ithblue dye。 4.检测权利要求1所述分子标记组合的试剂在鉴别芦 笋性别中的应用。 5.根据权利要求 4所述的应用， 其特 征在于， 所述试剂包括权利要求2所述引物组。 6.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述性别包括超雄株、 雌株和雄株中的一 种或两种以上。 7.基于权利要求2所述引物组或权利要求3所述试剂 盒的鉴定芦笋性别的方法， 包括以 下步骤： 取待测的芦 笋植物材 料， 提取单株总DNA； 以所述单株总DNA为模板， 利用权利要求2所述引物组或权利要求3所述的试剂盒在同 一个反应 体系中进行PCR扩增， 得到扩增产物； 将扩增产物进行凝胶电泳检测； 观察电泳结果， 出现大小为293bp 单一条带的为超雄株， 出现245bp 单一条带的为雌株， 出现245bp和2 93bp双条带的为雄株。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述反应体系中， 每20μL所述反应体系包 括： 2×M5 Hiper超光速mix  withblue  dye 10 μL， 浓度为10 μmol/L的引物各0.5 μL， 浓度为 50～100ng/ μL的模板DNA  1 μL， ddH2O 7 μL。 9.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的条件包括： 95℃预变性30s； 94℃变性3 0s， 59℃退火3 0s， 72℃延伸40s， 执 行30个循环； 72℃延伸5mi n。 10.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述凝胶电泳检测的条件包括： 将所述扩 增产物在2g/mL的琼脂糖凝胶中以20 0V电压电泳 30min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114717354 A 2一种芦笋超雄株鉴定用分子标记组合、 引物组、 试剂盒、 鉴定 方法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及 植物分子遗传学技术领域， 进一步涉及基于分子标记的植物性别鉴别 技术， 具体涉及一种芦 笋超雄株鉴定用分子标记组合、 引物组、 试剂盒、 鉴定方法及应用。 背景技术 [0002]芦笋(Asparagus  officinalis  L.)为天门冬科天门冬属多年生草本植物， 其幼茎 质嫩味美， 营养丰富， 风味独特， 是一种具有较高药用、 营养和保健价值的高档蔬菜， 畅销全 球， 享有“蔬菜之王 ”的美誉。 [0003]芦笋为典型的雌雄异株植物， 具有XY型性别决定系统。 芦笋的自然群体中性别表 现型有4种， 分别 为雌性、 雄性、 超雄性和两性株， 其性染色体组成分别为XX， XY， YY和XY。 其 中两性株可以发育出正常两性花， 因此可以进行自花或异花授粉即自交， 常用于芦笋的育 种研究； 超雄株可以正常生长发育， 其形态及生理等各方面特征均与正常雄株相同， 但其与 雌株杂交的后代全为雄性， 因此超雄株对于芦笋育种 具有重要的意义。 实际栽培过程中发 现， 同样的条件 下， 雄株芦笋生长快、 寿命长、 抗性 强， 产量比雌株高25％左右， 因此， 由全部 雄株组成的全雄品种目前占全球芦笋种子 市场主导地位。 芦笋全雄育种技术展现出其他育 种方法所不能及的优势， 而全雄育种的关键就是筛选出在群体中比例极小的超雄株做父 本， 但是芦笋幼 苗期无法从植株表型上判断性别， 即使开花后也仅能判断雄株和雌株， 而 无 法区分雄株和超雄株， 这给超雄株的筛选工作造成很大 的困难。 传统的筛选是采用遗传学 方法将雄株或超雄株与雌株进行单株杂交， 看F1后代株系性别表现， 若F1雌雄性别比约为 1： 1， 则父本为雄株； 而若F1全为雄株， 则父本为超雄株。 该方法虽然可以鉴别雄株和超雄 株， 但是需要做大量的杂交， 且需2 ～3年， 耗时费力。 [0004]使用现代分子标记技术可以辅助芦笋育种， 提高筛选超雄株的效率， 大大缩短育 种周期。 但是目前的芦笋分子标记大多 是鉴别雌雄的分子标记， 其应用仅局限于雌、 雄性别 的鉴别区分， 关于超雄株的鉴定目前仅有2例报道。 1998年， Reamon ‑Büttner等利用非放射 性的AFLP技术和BSA法， 筛选到3个与性别基因连锁的标记， 这3个标记都是在雌株中无扩增 条带， 在雄株中有扩增条带， 而在 超雄株中的扩增条带比在一般雄株中的亮度强， 可以作为 区分雄株和超雄株的共显性标记。 Gebler 等(2007)研究发现1条约700bp的RAPD引物扩增条 带与芦笋性别基因紧密连锁： 出现强条带的植株是雌株， 出现弱条带的植株是雄株， 而没有 出现该条带的可能是超雄株。 由此可见， 目前尽管有能区分芦笋雄株和超雄株的分子标记， 但都存在着很大 的缺陷， 有的仅仅是条带亮度上 的差别， 这种 条带强弱类型 的标记在实际 生产中很难判断而 无法直接应用于标记选择， 而另外的标记则不稳定。 同时， 由于前人开 发 的这些分子标记都不是基于性别连锁基因的， 均不是与性别表型共分离的功 能性标记， 检 测结果往 往存在一定假阳性和误差 。 [0005]2017年， 芦笋基因组序列被解析， 同时解析了其Y染色体(Harkess等)， 2020年， 其X 染色体也被解析(Har kess等)， 这为芦笋遗传学研究， 尤其是分子水平上的品种改良奠定了说　明　书 1/6 页 3 CN 114717354 A 3