(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210380002.2 (22)申请日 2022.04.12 (71)申请人 江苏省农业科 学院 地址 210000 江苏省南京市孝陵卫钟灵街 50号 (72)发明人 陈智慧　杨杰　陶亚军　王军　 王芳权　许扬　范方军　李文奇　 李霞　蒋彦婕　 (74)专利代理 机构 南京创略知识产权代理事务 所(普通合伙) 32358 专利代理师 李荣芳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/84(2006.01)C12N 9/12(2006.01) A01H 6/46(2018.01) A01H 5/00(2018.01) (54)发明名称 水稻抽穗期调控基因Hd6的靶向敲除方法及 其突变体和应用 (57)摘要 本发明公开水稻抽穗期调控基因 Hd6的靶向 敲除方法及其突变体和应用， 本发 明具体地公开 了一种使用CRISPR/Cas9技术编辑水稻 Hd6基因， 创制新的等位突变调控水稻抽穗期的方法， 并公 开了两个编辑靶位点及获得的七种新等位突变 体。 实验证明， 与野生型相比， 这七种突变类型均 引起水稻抽穗期提前。 通过本发明提供的方法， 大大缩短早熟水稻品种选育的周期， 扩大水稻品 种种植区域。 为水稻新品种选育提供一种高效的 调控抽穗期的方法， 在农业生产上具有十分重要 的应用。 权利要求书2页 说明书10页 序列表14页 附图5页 CN 115044660 A 2022.09.13 CN 115044660 A 1.一种水稻 Hd6基因功能的检测方法， 其特征在于： 根据日本晴的 Hd6基因和Kasalath 的Hd6等位基因的差异， 设计PCR扩增特异性引物， 扩增水稻 Hd6基因， 然后测序并与日本晴 和Kasalath的 Hd6基因序列进行比对， 进而确定水稻的 Hd6基因功能； 所述特异性引物碱基 序列如SEQ  ID NO:1和SEQ  ID NO:2所示。 2.一种水稻 Hd6基因靶向敲除方法， 其特征在于： 利用CRISPR/Cas9系统对水稻 Hd6基因 进行靶向编辑， 所述CRISPR/Cas9系统靶向编辑的靶点为位于 Hd6基因的第一外显子第 1161‑1181处的Target  site1和第四外 显子第3728 ‑3748处的Target  site2。 3.根据权利要求2所述的敲除方法， 其特征在于： 所述靶向编辑的水稻， 其 Hd6基因是具 有功能的。 4.根据权利要求2所述的敲除方法， 其特征在于： 所述CRISPR/Cas9系统靶向敲除的靶 点Target site1序列如SEQ  ID NO:6所示， 靶点Target  site2序列如SEQ  ID NO:7所示。 5.根据权利要求2所述的敲除方法， 其特征在于： 所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向 所述Hd6基因靶点序列的sgRNA的载体。 6.一种用于筛选水稻 Hd6基因的突变体的引物对， 其特征在于： 该引物对为根据权利要 求2或4所述的 Hd6基因两个靶点Target  site1和Target  site2的序列设计： 根据Target  site1序列设计的特异性测序引物序列如SEQ  ID NO:18和SEQ  ID NO:19 所示； 根据Target  site2序列设计的特异性测序引物序列如SEQ  ID NO:20和SEQ  ID NO:21 所示。 7.一种水稻 Hd6基因的突变体， 其特征在于： 所述的突变体为采用权利要求2 ‑5任意一 项所述的敲除方法创制， 并通过权利要求6所述的引物对筛 选获得。 8.根据权利要求7 所述的突变 体， 其特征在于： 所述 突变体为下述任意 一种： 突变体M0， 其在如SEQ  ID NO:5所示的DNA序列第一外显子 处第1173 ‑1177位的5个碱基 缺失， 第四外显子处第3744 ‑3745之间增加一个碱基； 其位于Target  site1处核苷 酸序列如 SEQ ID NO:22所示， 位于Target  site2处核苷酸序列如SEQ  ID NO:29所示， 氨基酸序列如 SEQ ID NO:37所示； 突变体M2， 其在如SEQ  ID NO:5所示的DNA序列第一外显子 处第1174 ‑1180位的7个碱基 缺失， 第四外显子处第3742 ‑3759位的18个碱基缺失； 其位于Target  site1处核苷酸序列如 SEQ ID NO:23所示， 位于Target  site2处核苷酸序列如SEQ  ID NO:30所示， 氨基酸序列如 SEQ ID NO:38所示； 突变体M4， 其在如SEQ  ID NO:5所示的DNA序列第一外显子处第1168 ‑1177位的10个碱 基被另外21个碱基替换， 第四外显子处第3729 ‑3747位的19个碱基缺失； 其位于Target   site1处核苷酸序列如SEQ  ID NO:24所示， 位于Target  site2处核苷酸序列如SEQ  ID NO: 31所示， 氨基酸序列如SEQ  ID NO:39所示； 突变体M5， 其在如SEQ  ID NO:5所示的DNA序列第一外显子 处第1178 ‑1179之间1个碱基 插入， 第四外显子处第3 737‑3744， 3747 ‑3748位的10个碱基缺失； 其位于Target  site1处核 苷酸序列如SEQ  ID NO:25所示， 位于Target  site2处核苷酸序列如SEQ  ID NO:32所示， 氨 基酸序列如SEQ  ID NO:40所示； 突变体M6， 其在如SEQ  ID NO:5所示的DNA序列第一外显子 处第1178 ‑1179之间插入 1个权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115044660 A 2碱基， 第四外显子处第3729 ‑3747位的19个碱基缺失； 其位于Target  site1处核苷酸序列如 SEQ ID NO:26所示， 位于Target  site2处核苷酸序列如SEQ  ID NO:33所示， 氨基酸序列如 SEQ ID NO:41所示； 突变体M7， 其在如SEQ  ID NO:5所示的DNA序列第四外显子处第3745 ‑3762位的18个碱 基缺失； 其位于Target  site1处核苷酸序列如SEQ  ID NO:27所示， 位于Target  site2处核 苷酸序列如SEQ  ID NO:34所示， 氨基酸序列如SEQ  ID NO:42所示； 突变体M8， 其在如SEQ  ID NO:5所示的DNA序列第一外显子处第1168 ‑1177位的10个碱 基缺失， 第四外显子处第3738 ‑3779位的42 个碱基缺失， 内含子3780 ‑4188位的339 个碱基缺 失； 其位于Target  site1处核苷酸序列如SEQ  ID NO:28所示， 位于Target  site2处核苷酸 序列如SEQ  ID NO:35所示， 氨基酸序列如SEQ  ID NO:43所示。 9.权利要求2 ‑5任意一项所述的水稻 Hd6基因靶向敲除方法在调控水稻抽穗期上的应 用， 其特征在于： 将含有CRISPR/Cas9系统靶向编辑的靶位点序列的最 终载体转染水稻愈伤 组织， 再生获得转基因水稻植株； 然后采用权利要求6所述的引物对筛选水稻突变植株， 获 得抽穗期提前的水稻突变 株系。 10.权利要求9所述的敲除方法在调控水稻抽穗期上的应用， 其特征在于： 所述水稻突 变株系的抽穗期提前4～12天。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115044660 A 3