(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210370682.X (22)申请日 2022.04.11 (71)申请人 潍坊华卓生物科技有限公司 地址 261100 山东省潍坊市经济开发区北 海路2333号潍坊万创空间一期3座商 务办公楼102室 申请人 潍坊吉因生物科技有限公司 　 贝南生物科技 （厦门） 有限公司 　 潍坊华英生物科技有限公司 　 山东省畜产品质量 安全中心 （山 东 省畜禽屠宰 技术中心） (72)发明人 张琦　张勇　王宏华　童超　 陈智林　王辉　孙伟　徐婷婷　 王迎迎　翟坤龙　(74)专利代理 机构 威海恒誉润达专利代理事务 所(普通合伙) 3726 0 专利代理师 戚笑颐 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测多种常见鸭源病毒的试剂盒及检 测方法 (57)摘要 本发明提供了一种检测多种常见鸭源病毒 的试剂盒及检测方法， 其解决了现有的鸭源病毒 检测手段存在检测时间长、 灵敏度低、 操作步骤 繁琐且易发生交叉感染的技术问题。 试剂盒包含 反应试剂， 反应试剂包括鸭甲型肝炎病毒1型特 异性引物及探针、 鸭甲型肝炎病毒3型特异性引 物及探针、 鸭星状病毒特异性引物及探针、 鸭副 黏病毒特异性引物及探针、 缓冲液、 酶混合液和 冻干保护剂。 本发明同时提供与多种常见鸭源病 毒的试剂盒联合的多重荧光PCR检测方法。 本发 明可广泛应用于生物信息 检测技术领域。 权利要求书2页 说明书9页 序列表3页 附图7页 CN 114438266 A 2022.05.06 CN 114438266 A 1.一种检测多种常见鸭源病 毒的试剂 盒， 其特征在于： 包含反应试剂， 所述反应试剂包 括鸭甲型肝炎病毒1型特异性引物及探针、 鸭甲型肝炎病毒3型特异性引物及探针、 鸭星状 病毒特异性引物及探针、 鸭副黏病毒特异性引物及探针、 缓冲液、 酶混合液和冻干保护剂， 鸭甲型肝炎病毒1型、 鸭甲型肝炎病毒3型、 鸭星状病毒、 鸭副黏病毒 特异性引物均包括上游 引物和下游引物， 鸭甲型肝炎1型上游引物序列如SEQID  NO:1所示， 鸭甲型肝炎1型下游引 物为序列如SEQID  NO:2所示， 鸭甲型肝炎1型探针序列如SEQID  NO:3所示； 鸭甲型肝炎3型 上游引物序列如SEQID  NO:4所示， 鸭甲型肝炎3型下游引物序列如SEQID  NO:5所示， 鸭甲型 肝炎3型探针序列如SEQID  NO:6所示； 鸭星状病毒上游引物序列如SEQID  NO:7所示， 鸭星状 病毒下游引物序列如SEQID  NO:8所示， 鸭星状病毒探针序列如SEQID  NO:9所示； 鸭副黏病 毒上游引物序列如SEQID  NO:10所示， 鸭副黏病毒下游引物序列如SEQID  NO:11所示， 鸭副 黏病毒探针序列如SEQID  NO:12所示， 鸭甲型肝炎病毒1型探针、 鸭甲型肝炎病毒3型探针、 鸭星状病毒探针、 鸭副黏病毒探针的5'端包括  FAM、 HEX、 ROX或CY5  的荧光报告基团， 3'端 包括 BHQ1、 BHQ2的荧 光淬灭基团。 2.根据权利要求1所述的检测多种常见鸭源病 毒的试剂 盒， 其特征在于： 所述试剂 盒还 包括阳性对照品和阴性对照品， 所述阳性对照品包含鸭甲型肝炎病毒1型质粒、 鸭甲型肝炎 病毒3型质粒、 鸭星状病毒质粒、 鸭副黏病毒质粒及冻干保护剂； 所述阴性对照品包 含TE水。 3.根据权利要求1所述的检测多种常见鸭源病 毒的试剂 盒， 其特征在于： 鸭甲型肝炎病 毒1型、 鸭甲型肝炎病毒3型、 鸭星状病毒、 鸭副黏病毒的上下游引物浓度均为600nmol/L， 鸭 甲型肝炎病毒1型、 鸭甲型肝炎病毒3型、 鸭星状病毒、 鸭副黏病毒的探针浓度均为150nmol/ L。 4.根据权利要求1所述的检测多种常见鸭源病 毒的试剂 盒， 其特征在于： 所述缓冲 液包 含30mmol/L  PH为8.8的Tris， 120mmol/L  KCl和1%DMSO、 300μmol/L  dNTPs和3.5mmol/L   MgCl2。 5.根据权利要求1所述的检测多种常见鸭源病 毒的试剂 盒， 其特征在于： 所述酶混合液 为5UHs‑Taq酶和2.5U  M‑MLV酶。 6.根据权利要求1或2所述的检测多种常见鸭源病毒的试剂盒， 其特征在于： 冻干保护 剂为5%甘油， 2.5%蔗糖和1% 甘氨酸的混合物。 7.根据权利要求2所述的检测多种常见鸭源病 毒的试剂 盒， 其特征在于： 所述反应试剂 和阳性对照品为冻干粉状试剂。 8.一种利用权利要求1所述的检测多种常见鸭源病毒的试剂盒的检测方法， 其特征在 于， 包括以下步骤： S1.对待测样本进行核酸 提取； S2.将鸭甲型肝炎病毒1型特异性引物及探针、 鸭甲型肝炎病毒3型特异性引物及探针、 鸭星状病毒 特异性引物及探针、 鸭副黏病毒 特异性引物及探针、 缓冲液、 酶混合液和冻干保 护剂混合， ‑20℃预冻6小时， 真空干燥， 2 ‑8℃避光保存； S3.以鸭甲型肝炎病毒1型质粒、 鸭甲型肝炎病毒3型质粒、 鸭星状病毒质粒、 鸭副黏病 毒质粒及冻干 保护剂作为阳性对照品， ‑20℃预冻6小时， 真空干燥， 2 ‑8℃避光保存， 以TE水 作为阴性对照品； S4.分别使用鸭甲型肝炎病毒1型特异性引物及探针、 鸭甲型肝炎病毒3型特异性引物权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114438266 A 2及探针、 鸭星状病毒特异性引物及探针、 鸭副黏病毒特异性引物及探针进行多重荧光定量 PCR检测； S5.通过收集的荧 光曲线和Ct值判定结果； 所述利用检测多种常见鸭源病毒的试剂盒的检测方法不用于疾病诊断或治疗。 9.根据权利要求8所述的检测多种常见鸭源病毒的试剂盒的检测方法， 其特征在于： PCR扩增条件为： 50℃逆转录  20min， 93℃预变性  2min； 93℃ 变性10s， 55℃检测 信号35s， 循环40次。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114438266 A 3