(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210377493.5 (22)申请日 2022.04.11 (71)申请人 郑州大学第一附属医院 地址 450052 河南省郑州市二七区建 设东 路50号 (72)发明人 饶本臣　任志刚　余祖江　 (74)专利代理 机构 杭州中成专利事务所有限公 司 33212 专利代理师 朱莹莹 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6869(2018.01) G16B 5/00(2019.01)G16B 30/00(2019.01) G16B 40/00(2019.01) (54)发明名称 用于区别胆管细胞癌和健康人群的口腔微 生物基因标志 物及其应用 (57)摘要 本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及一 种区别胆管细胞癌和健康人群的口腔微生物基 因标志物及其应用。 本发明提供了一种用于区别 胆管细胞癌和健康人群的口腔微生物基因标志 物， 由SEQ  ID NO:1‑3所示的3种微生物基因组 成， 所述微生物基因在人体口腔中明显富集。 因 此， 本发明的微生物基因区别模 型在胆管细胞癌 和健康人群中实现了良好的区别能力。 也验证了 该区别模型的可 行性和适用性。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图6页 CN 114959077 A 2022.08.30 CN 114959077 A 1.一种用于区别胆管细胞癌和健康人群的口腔微生物基因标志物， 其特征在于： 由SEQ   IDNO:1‑3所示的3种微 生物基因 组成， 所述 微生物在口腔中 明显富集。 2.一种用于检测权利要求1所述口腔微生物基因标志物的检测试剂， 包括用于检测权 利要求1所述的SEQ  ID NO:1‑3所示的3种微 生物基因的引物。 3.根据权利要求2所述的检测试剂， 其特 征在于： 所述引物序列为SEQ  ID NO:4‑5。 4.权利要求2或3所述检测试剂在制备胆管细胞癌和健康人群的区分检测试剂盒中的 应用， 所述检测试剂适用于检测权利要求1所述的 口腔微生物基因。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于： 通过收集入组对象的唾液样本， 抽提微生 物总DNA， 完成微生物DNA的16S  rDNA Miseq测序， 检测是否存在权利要求1所述的3种微生 物基因。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于： 通过收集入组对象的唾液样本， 抽提微生 物总DNA， 进行口腔菌群的16S  rDNA Miseq测序； 基于高通量测序数据， 在队列中建立胆管 细胞癌患者和健康人群的微生物区别模型， 建立胆管细胞癌患病率POD指数； POD指数可用 于计算其区别能力， 进行验证。 7.根据权利要求 4所述的应用， 其特 征在于， 具体包括： (1)收集入组对象的唾液样本， 入组对象包括50例胆管细胞癌患者和100例健康人， 按 照DNA的标准抽提方法完成唾液样 本中微生物总DNA的抽提， 在Illumina  MiSeq平台完成口 腔菌群的16S  rDNA高通 量测序工作； (2)基于高通量测序数据， 在微生物区别模型的队列中， 在50例胆管细胞癌患者和100 例健康人之间， 基于一个随机森林模型， 通过一个五倍交叉验证的算法， 鉴定了用于该模型 的最佳的3个微 生物基因标志 物； (3)基于3个微生物基因标志物， 通过使用随机生成的决策树的比率来计算胆管细胞癌 患病率POD 指数； (4)该微生物区别模型在50例胆管细胞癌患者和100例健康人之间的区别能力达到 99.22％， POD指数在胆管细胞癌 患者中明显升高， 两组之间有显著性差异； (5)在验证集中， 该微生物区别模型在24例胆管细胞癌患者和50例健康对照之间的区 别能力达 到98.08％； POD 指数在胆管细胞癌 患者中明显升高， 两组之间有显著性差异。 8.一种用于区别胆管细胞癌患者和健康人群的口腔微生物模型的试剂盒， 包括用于检 测权利要求1所述的SEQ  ID NO:1‑3所示的3种微 生物基因的引物。 9.权利要求1所述口腔微生物基因标志物在构建适用于区分胆管细胞癌患 者和健康人 群的口腔微生物模型的应用。 10.一种用于区分胆管细胞癌患者和健康人群的口腔微生物模型， 其特征在于， 包括 SEQ IDNO:1‑3所示的3种微 生物基因。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959077 A 2用于区别胆管细胞癌和健康人群的口腔微生物基因标志物及 其应用 技术领域 [0001]本发明属于生物医药技术领域， 具体涉及 一种区别胆管细胞癌和健康人群的口腔 微生物基因标志 物及其应用。 背景技术 [0002]肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一， 2021年美国有42,230例新病例和30,230例死 亡。 原发性肝癌包括肝细胞癌(HCC)(占75％ ‑85％)和胆管细胞癌(CCA)(占10％ ‑15％)以及 其他罕见类型。 近年来， 胆管癌的患病率和死亡率都有所增加。 胆管癌呈散发性， 危险因素 存在地区差异。 在东南亚， CCA的常见危险因素是肝吸虫(Opisthorcis  viverrini和 Clonorchis  sinensis)、 慢性伤寒携带和慢性导管内胆结石， 以及胆总管(胆管)囊肿和 Caroli病(肝内胆管囊肿)。 然而， 在西方国家， 最重要的危险因素是原发性硬化性胆管炎 (PSC)。 还有其他风险因素， 包括胸腔放疗、 乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染 和肝硬化。 胆管癌因其解剖位置、 生长模式和缺乏明确的诊断标准而难以诊断。 尽管经常发 现和报告新的诊断生物标志物， 但存在许多局限性。 肝活检是诊断CCA的金标准， 但是， 它是 一种侵入性操作， 有时无法执行此操作。 因此， 迫切需要寻找 新的、 非侵入性的CCA诊断生物 标志物。 [0003]口腔微生态系统与健康和疾病密切相关。 众所周知， 口腔微生物菌群失调不仅会 导致口腔疾病， 例如龋齿、 牙周炎、 口腔粘膜疾病， 还会涉及全身性疾病， 包括胃肠系统疾 病， 例如炎性肠病、 肝硬化、 胰腺癌， 神经系统疾病， 例如阿尔茨海默氏病， 内分泌系统性疾 病， 例如糖尿病、 多囊卵巢综合征， 免疫系统疾病， 例如类风湿 关节炎和心血管系统疾病， 例 如动脉粥样硬化。 [0004]人类微生物组中关健功能菌可成为人类疾病的新型生物标志物。 基于肠道微生物 组建立疾病诊断模型已经在多个疾病中广泛应用， Qin  J等率先使用宏基因组学报道了肠 道微生态与 2型糖尿病的相关性， 指出23个菌种可能成为区分2型糖尿病的肠道微生物标志 物。 Qin N,Li A等(2014年Nature杂志)通过宏基因组测序技术解析了中国人群肝硬化患者 肠道微生态结构， 在微生物基因和功能水平上， 鉴定了肝硬化特异 性的15个标记物， 创建了 一个高准确度的肝硬化患者区分指数。 口腔微生态的特征或者基于口腔微生物建立的区别 模型作为特定疾病或肿 瘤的区分工具正越来越多被广泛报道和认可。 Cui  J等对78名胃炎 患者和50名健康个体进行研究， 提出口腔微生态可以作为胃炎及其癌前病变的无创标志 物。 Lu H,指出2个菌属(原细菌属和梭菌属)可能成为区分肝癌的口腔微生物标志物， 这是 基于口腔微生物组建立的无创诊断模型。 因而， 口腔微生物可能是不同疾病诊断的有力工 具。 然而， 用于区别胆管细胞癌和健康人群的 口腔微生物模型还未曾报道过。 发明内容 [0005]本发明提供了一种用于区别胆管细胞癌和健康人群的口腔微生物基因标志物， 由说　明　书 1/6 页 3 CN 114959077 A 3