(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210359991.7 (22)申请日 2022.04.07 (66)本国优先权数据 202111197436.0 2021.10.14 CN (71)申请人 湖南农业大 学 地址 410000 湖南省长 沙市农大路1号 (72)发明人 刘志　陈俊华　潘家峰　王伟平　 邓芳　袁小玲　 (74)专利代理 机构 长沙和雅知识产权代理事务 所(普通合伙) 43238 专利代理师 林传贵 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/682(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测水稻OsNramp5基因的方法及试剂 盒 (57)摘要 本发明属于分析检测技术领域， 具体涉及一 种荧光鉴定水稻镉低吸收基因OsNramp5的方法 及检测试剂盒。 本发明提供一种荧光鉴定水稻镉 低吸收基因OsNramp5的方法及检测试剂盒， 检测 试剂盒包括H1核酸发夹结构、 H2核酸发夹结构、 H3核酸发夹结构、 H4核酸发夹结构和缓冲液。 基 于DNAzyme催化的和催化发夹自组装(CHA)的放 大技术， 建立一种无酶的OsNramp5生物传感器。 本发明的方法具有良好的稳定性， 简单、 灵活的 设计且灵敏度高等独特优势， 易于大规模推广使 用。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 114959092 A 2022.08.30 CN 114959092 A 1.一种检测水稻OsNramp5基因的试剂盒， 其特征在于， 所述检测试剂盒包括H1核酸发 夹结构、 H2核酸发夹结构、 H 3核酸发夹结构、 H4核酸发夹结构和缓冲液。 2.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述H1核酸发夹结构包含OsNramp5识别 区域和Cd2+依赖性DNAzyme酶链。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述H1核酸发夹结构的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1所示。 4.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述H2核酸发夹结构包含Cd2+依赖性 DNAzyme底 物链。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述H2核酸发夹结构的核苷酸序列如 SEQ ID NO:2所示。 6.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述H3核酸发夹结构的核苷酸序列如 SEQ ID NO:3所示。 7.根据权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述H3核酸发夹结构的两侧连接荧光基 团和荧光猝灭基团。 8.根据权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述荧光基团为Cy5； 所述荧光猝灭基团 为BHQ2。 9.根据权利要求8所述的试剂盒， 其特征在于， 所述H4核酸发夹结构与H3核酸发夹结构 的核酸序列碱基部分互补， H4核酸发夹结构的核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示。 10.根据权利要求1 ‑9任一所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述缓冲液包括M ES缓冲液。 11.根据权利要求10所述的试剂盒， 其特征在于， 所述MES缓冲液包含25mM  NaCl， 1μM   Cd2+， pH＝6.0 。 12.一种利用权利要求1 ‑11任一所述的试剂盒来鉴定水稻OsNramp5基因的方法， 其特 征在于， 包括下列步骤： (1)H1、 H2、 H3、 H4核酸发夹结构的形成： H1、 H2、 H3和H4核酸发夹结构分别在缓冲液中加 热到95℃  5min， 并冷却到室温； (2)OsNramp5基因的检测： 将200nM  H1核酸发夹结构、 600nM  H2核酸发夹结构与待测液 在25℃存在1 μM  Cd2+的条件下孵育30分钟； 将600 nM H3核酸发夹结构和1200nM  H4核酸发夹 结构加入到上述溶液中， 室温孵育60min， 在590 ‑750nm范围内观察到荧光光谱， 从而达到检 测OsNramp5基因的目的。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114959092 A 2一种检测水稻OsNr amp5基因的方 法及试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于分析检测技术领域， 具体涉及一种检测水稻OsNramp5基因的方法及试 剂盒。 背景技术 [0002]镉是一种剧毒重金属， 可导致与镉相关的疾病。 稻米作为我国重要的主食， 对镉具 有较高的吸收效率， 易导致膳食中镉摄入量过高， 对人类健康构成严重威胁， 而且稻田环 境 中高浓度的镉还会影响水稻的正常生长发育。 因此， 迫切需要选育镉低吸收的水稻品种， 以 降低潜在的健康风险， 保障食品安全。 [0003]近年来， 越来越多的研究表明OsNramp5基因(OsN)是水稻中控制镉等重金属吸收 的一个关键基因， 该基因的缺失能显著减少根系对镉的吸收， 降低稻米中镉的含量。 目前， 已报道有关OsNramp5基因检测的方法， 如一种与水稻镉低吸收基因OsNramp5相关的SNP位 点及其应用(申请号20201161599 0.1)和用于检测水稻OsNRAMP5基因的特异InDel分子标记 引物及其应用(申请号202010239340.5)都采用PCR扩增检测， 需要DNA聚合酶、 费时、 成本较 高和存在假阳性等。 本发明利用该基因作为反向分子生物标志物， 建立一种无酶的   OsNramp5生物传感器， 并开发简单、 快速、 低成本的镉低吸收基因鉴定与试剂盒， 从而对镉 低吸收水稻种质资源材料的鉴定、 品种选育和保障稻米品质安全以及育种平台部署等方面 具有重要意 义。 发明内容 [0004]本发明所要解决的技术问题是， 克服以上背景技术中提到 的不足和缺陷， 提供一 种荧光鉴定水稻镉低吸收基因OsNramp5的方法及检测试剂盒。 基于DNAzyme催化的和催化 发夹自组装(CHA)的放大技术， 建立一种无酶的OsNramp5生物传感器。 所述方法具有良好的 稳定性， 简单、 灵活的设计且灵敏度高等独特优势， 易于大规模推广使用。 [0005]本发明所采取的技 术方案是： [0006]一种荧光鉴定水稻镉低吸收基因OsNramp 5的检测试剂盒， 所述检测试剂盒包括H 1 核酸发夹结构、 H2核酸发夹结构、 H 3核酸发夹结构、 H4核酸发夹结构和缓冲液。 [0007]优选地， H1核酸发夹结构包 含OsNramp5识别区域和Cd2+依赖性DNAzyme酶链。 [0008]优选地， H1核酸发夹结构的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示。 [0009]优选地， H2核酸发夹结构包 含Cd2+依赖性DNAzyme底 物链。 [0010]优选地， H2核酸发夹结构的核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示。 [0011]优选地， H 3核酸发夹结构的核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示。 [0012]优选地， H 3核酸发夹结构的两侧连接荧 光基团和荧 光猝灭基团。 [0013]优选地， 荧 光基团为Cy5； 所述 荧光猝灭基团为BHQ2。 [0014]优选地， H4核酸发夹结构与H3核酸发夹结构的核酸序列碱基部分互补， H4核酸发 夹结构的核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示。说　明　书 1/5 页 3 CN 114959092 A 3