(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210357806.0 (22)申请日 2022.04.06 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114657286 A (43)申请公布日 2022.06.24 (73)专利权人 中国人民解 放军军事科学院军事 医学研究院 地址 100082 北京市海淀区太平路27号院 (72)发明人 刘琪琦　程子恩　周喆　侯广争　 曹鹏程　丁艳磊　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 专利代理师 王闯 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) C12R 1/35(2006.01) C12R 1/46(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (56)对比文件 CN 112813196 A,2021.0 5.18 CN 113267623 A,2021.08.17 CN 111394514 A,2020.07.10 CN 109355437 A,2019.02.19 罗琴等. 《2 2种呼吸道病原体核酸多重联检 试剂盒检测效能评估》 . 《疾病监测》 .2021,第37 卷(第1期),第132-138页. 审查员 王斯奇 (54)发明名称 一种同时检测12种呼吸道病原体的引物探 针组合、 试剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种同时检测12种呼吸道病 原体的引物探针组合、 试剂盒及检测方法， 涉及 生物检测技术领域。 本发明可实现通过一次反应 同时检测多种不同类型的呼吸道病原 体， 检测全 面、 效率高、 特异性好、 灵敏度高。 本发明方法操 作简便， 克服了常规单重荧光PCR单孔单检的繁 琐步骤， 可应用于高通量病原体筛查， 对呼吸道 感染性疾病的临床诊断和防控具有重要的现实 意义。 权利要求书2页 说明书15页 序列表7页 附图11页 CN 114657286 B 2022.10.14 CN 114657286 B 1.一种同时检测12种呼吸道病原体的引物探针组合， 其特 征在于， 包括： 用于新型冠状病毒检测的上下游引物序列如SEQ  ID No.1和SEQ  ID No.2所示， 探针序 列如SEQ ID No.3所示； 用于甲型流感病毒检测的上下游引物序列如SEQ  ID No.4和SEQ  ID No.5所示， 探针序 列如SEQ ID No.6所示； 用于乙型流感病毒检测的上下游引物序列如SEQ  ID No.7和SEQ  ID No.8所示， 探针序 列如SEQ ID No.9所示； 用于呼吸道合胞病毒检测的上下游引物序列如SEQ  ID No.10和SEQ  ID No.11所示， 探 针序列如SEQ  ID No.12所示； 用于腺病毒检测的上下游引物序列如SEQ  ID No.13和SEQ  ID No.14所示， 探针序列如 SEQ ID No.15和SEQ  ID No.16所示； 用于副流感病毒1型检测的上下游引物序列如SEQ  ID No.17和SEQ  ID No.18所示， 探 针序列如SEQ  ID No.19所示； 用于副流感病毒2型检测的上下游引物序列如SEQ  ID No.20和SEQ  ID No.21所示， 探 针序列如SEQ  ID No.22所示； 用于副流感病毒3型检测的上下游引物序列如SEQ  ID No.23和SEQ  ID No.24所示， 探 针序列如SEQ  ID No.25所示； 用于嗜肺军团菌检测的上下游引物序列如SEQ  ID No.26和SEQ  ID No.27所示， 探针序 列如SEQ ID No.28所示； 用于肺炎支原体检测的上下游引物序列如SEQ  ID No.29和SEQ  ID No.30所示， 上下游 探针序列如SEQ  ID No.31和SEQ  ID No.32所示； 用于肺炎衣原体检测的上下游引物序列如SEQ  ID No.33和SEQ  ID No.34所示， 探针序 列如SEQ ID No.35所示； 用于肺炎链球菌检测的上下游引物序列如SEQ  ID No.36和SEQ  ID No.37所示， 探针序 列如SEQ ID No.38所示。 2.根据权利要求1所述的引物探针组合， 其特征在于， 所述引物探针组合还包括用于扩 增内参基因的上下游引物和探针； 所述扩增内参基因的上下游引物的序列如SEQ  ID No.39 和SEQ ID No.40所示， 探针序列如SEQ  ID No.41所示。 3.根据权利要求2所述的引物探针组合， 其特征在于， 所述探针序列的5 ’端标记有荧光 基团， 3’端标记有淬灭基团； 所述荧光基团选自FAM、 VIC、 ROX和CY5中的任一种， 所述淬灭基 团选自BHQ1或BHQ2。 4.根据权利要求3所述的引物探针组合， 其特征在于， 所述腺病毒的探针的5 ’端标记有 FAM荧光基团， 3 ’端标记有淬灭基团BHQ1； 所述嗜肺军团菌的探针的5 ’端标记有VIC荧光基 团， 3’端标记有淬灭基团BHQ1； 所述新型冠状病毒的探针的5 ’端标记有CY5荧光基团， 3 ’端 标记有淬灭基团BHQ 1； 所述甲型流 感病毒的探针的5 ’端标记有FAM荧光基团， 3 ’端标记有淬 灭基团BHQ1； 所述呼吸道 合胞病毒的探针的5 ’端标记有VIC荧光基团， 3 ’端标记有淬灭基团 BHQ1； 所述乙型流感病毒的探针的5 ’端标记有CY5荧光基团， 3 ’端标记有淬灭基团BHQ1； 所 述副流感病毒1型的探针的5 ’端标记有FAM荧光基团， 3 ’端标记有淬灭基团BHQ1； 所述副流 感病毒2型的探针的5 ’端标记有VIC荧光基团， 3 ’端标记有淬灭基团BHQ 1； 所述副流 感病毒3权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114657286 B 2型的探针的5 ’端标记有CY5荧光基团， 3 ’端标记有淬灭基团BHQ 1； 所述肺炎支原体的探针的 5’端标记有FAM荧光基团， 3 ’端标记有淬灭基团BHQ1， 所述肺炎衣原体的探针的5 ’端标记有 VIC荧光基团， 3 ’端标记有淬灭基团BHQ1； 所述肺炎链球菌的探针的5 ’端标记有CY5荧光基 团， 3’端标记有淬灭基团BHQ1； 所述内参基因的探针的5 ’端标记有ROX， 3 ’端标记有荧光淬 灭基团BHQ2。 5.一种同时检测12种呼吸道病原体的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1 ‑4中任一项 所述的引物探针组合； 所述试剂盒还包括病原体阳性质控品、 阴性质控品和荧光定量P CR检 测试剂； 所述病原体阳性质控品为含有12种呼吸道病原体检测靶标序列的质粒DNA， 所述阴 性质控品为含有人 上皮细胞的细胞培 养液。 6.根据权利 要求5所述的试剂盒， 其特征在于， 所述荧光定量PCR检测试剂还包括PCR反 应缓冲液、 反应酶、 dNTPs、 MgCl2、 RNase free H2O。 7.根据权利要求5或6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中， 各引物的浓度为50 ‑ 100 μmol/L； 各探针的浓度为5 0‑100 μmol/L。 8.一种非疾病诊断目的的用于检测12种呼吸道病原体的荧光定量PCR方法， 其特征在 于， 所述方法包括在荧光定量P CR扩增中使用权利要求 1‑4中任一项 所述的引物探针组合或 使用权利要求5 ‑7中任一项所述的试剂盒进行检测。 9.根据权利 要求8所述的荧光定量PCR方法， 其特征在于， 所述荧光定量PCR检测方法为 四管四重实时荧光P CR反应， 其中， 新型冠状病毒、 腺病毒、 嗜肺军团菌和内参基因的引物和 探针为一组， 在一个管内进行扩增反应； 甲型流感病毒、 乙型流感病毒、 呼吸道合胞病毒和 内参基因的引物和探针为一组， 在一个管内进 行扩增反应； 副流 感病毒1型、 副流感病毒2型 和副流感病毒3型和 内参基因的引物和探针为一组， 在一个管内进行扩增反应； 肺炎支原 体、 肺炎衣原体、 肺炎链球菌和内参基因的引物和探针为 一组， 在一个管内进行扩增反应。 10.根据权利要求8或9所述的荧光定量PCR方法， 其特征在于， PCR扩增反应的条件为： 45‑50℃ 20 min， 1个循环； 9 5‑98℃ 20 min， 1个循环； 9 5‑98℃ 15 s， 50‑60℃ 30 s， 35‑45 个循环， 在退火延伸阶段读取荧 光。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114657286 B 3