(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210358213.6 (22)申请日 2022.04.06 (71)申请人 厦门飞朔生物技 术有限公司 地址 361100 福建省厦门市同安区西柯镇 西洲路2041号四层401单 元 (72)发明人 陈志宏　吴水英　陈琰　 (74)专利代理 机构 深圳市兰锋盛世知识产权代 理有限公司 4 4504 专利代理师 罗炳锋 (51)Int.Cl. C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于加尾引物设计的Sanger测序方法 (57)摘要 本发明涉及基因测序的技术领域， 特别是一 种基于加尾引物设计的Sanger测序方法， 包括如 下步骤： (1)根据样本DNA选择特异性引物序列， 之后在特异性引物序列的5 ’端加上通用引物序 列得到加尾引物序列， 根据加尾引物序列合成加 尾引物； (2)使用加尾引物配制PCR扩增反应液， 加入样本DNA， 执行PCR扩增程序， 得到PCR扩增产 物； (3)PCR扩增产物进行纯化； (4)选 择通用引物 作为测序引物,对纯化的PCR扩增产物进行循环 测序反应； (5)循环测序反应产物经过纯化、 变 性、 上机测序得到样本DNA的序列， 本发明通过通 用序列和特异性序列引物的结合不仅可以节省 Sanger测序的工作量， 也可以降低引物加错的可 能性。 权利要求书1页 说明书10页 附图2页 CN 114703267 A 2022.07.05 CN 114703267 A 1.一种基于加尾引物设计的Sanger测序方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)根据样本DNA选择特异性引物序列， 之后在特异性引物序列的5 ’端加上通用引物序 列得到加尾引物序列， 最后根据加尾引物序列合成加尾引物； (2)使用加尾引 物配制PCR扩增 反应液， 之后加入样本DNA得到PCR扩增 反应体系， 之后 执行PCR扩增程序， 得到PCR扩增产物； (3)使用虾碱酶与外切酶配置成消化液， PCR扩增产物离心后， 将消化液加入PCR反应液 中进行， 反应得到纯化的PCR扩增产物； (4)选择正向或反向通用引物作为测序引物,对纯化的PCR扩增产物进行循环测序反 应； (5)循环测序反应产物经 过纯化、 变性、 上机测序得到样本DNA的序列。 2.如权利 要求1所述的基于加尾引物设计的Sanger测序 方法， 其特征在于， 通用引物为 是任意常见的通用引物或Tm值5 0‑65℃的序列。 3.如权利 要求2所述的基于加尾引物设计的Sanger测序 方法， 其特征在于， 通用引物的 选择中， 以序列M13 F： GTAAAA CGACGGCCAGT 为正向通用引物， 序列T7： TAATA CGACTCACTATAGGG 为反向通用引物。 4.如权利 要求1所述的基于加尾引物设计的Sanger测序 方法， 其特征在于， 特异性引物 为PDGFRAe12 ‑F2、 PDGFRAe12 ‑R1、 PDGFRAe18 ‑F1、 PDGFRAe18 ‑R1、 KITe9 ‑F1、 KITe9 ‑R1、 KITe11‑F2、 KITe11 ‑R2、 KITe13 ‑F1、 KITe13 ‑R1、 KITe17 ‑F1、 KITe17 ‑R2、 UP‑F‑M13F、 UP‑R‑ T7、 MHL1‑BSP1‑F2或MHL1‑BSP1‑R3。 5.如权利要求1所述的基于加尾引物设计的Sanger测序方法， 其特征在于， 每20μL的 PCR扩增反应液包括： 10.4 μL纯化水， 5 μL、 pH7.5的5X  PCR缓冲液、 4 μL、 25mM的MgCl2、 0.2 μL、 25mM的dNTP、 0.1 μL、 10 μM的上游加尾引物、 0.1 μL、 10 μM的下游加尾引物和0.2 μL  Taq酶； 每25 μL的PCR扩增反应 体系包括20 μL的PCR扩增反应液和5 μL的样本DNA。 6.如权利要求5所述的基于加尾引物设计的Sanger测序方法， 其特征在于， 步骤(2)中 加入样本DNA的浓度为5ng/ μl。 7.如权利要求1所述的基于加尾引物设计的Sanger测序方法， 其特征在于， 所述PCR扩 增程序如下： 9 5℃预变性2min； 循环： 95℃保持10s， 60℃保持30s， 72℃保持30s， 反应40个循 环； 4℃保存。 8.如权利 要求1所述的基于加尾引物设计的Sanger测序 方法， 其特征在于， 循环测序反 应体系， 以10 μL计包 括： 2 μL BigDye Reaction  Mix， 1 μL BigDye Sequencing  Buffer， 3.2 μ M、 0.5 μL测序引物， 4.5 μL无核酸酶水， 2 μl纯化PCR扩增产物。 9.如权利 要求1所述的基于加尾引物设计的Sanger测序 方法， 其特征在于， 循环测序反 应过程如下： 95℃预变性2min； 循环： 95℃ 保持10s， 50℃保持5s， 72℃ 保持90s， 反应25个循 环； 4℃保存。 10.如权利要求1所述的基于加尾引物设计的Sanger测序方法， 其特征在于， 所述样本 DNA为但不限于石蜡包埋DNA、 新鲜组织DNA或重亚硫酸盐转 化DNA样本 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703267 A 2一种基于加尾引物设计的Sa nger测序方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 基因测序的技术领域， 特别是一种基于加尾引物设计的Sanger测序方 法。 背景技术 [0002]Sanger测序法， 又称双脱氧链终止反应， 与化学降解法以及其衍生方法统称为第 一代DNA测序技术， 为人类基因组计划所使用的主要测序方法。 其原理是测序反应的核心 就 是利用ddNTP(由于缺少3' ‑OH基团， 不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力)， 这 些ddNTP可用来中止DNA链的延伸。 此外， 这些ddNTP上连接有放射性同位素或荧光标记基 团， 因此可以被自动化的仪器或凝胶成像系统所检测到 。 [0003]Sanger测序优势是(1)使用的测序技术准确度高于二三代测序。 基因突变可分为 碱基置换、 颠换、 缺失和 插入4种， sanger测序法对于任何一种突变都可以准确检测； (2)每 个反应可以得到700 ‑1000bp的长序列， 序列长度高于二代测序。 因此， Sanger测序作为基因 检测的金标准， 广泛应用于的靶基因测序， 二代测序和荧光PCR等检测方法的验证。 而 Sanger测序的主要劣势是一个反应只能得到一条序列， 测序通量低。 工作流程从样本制备 到最终数据分析， 包括PCR扩增、 P CR产物纯化、 循环测序反应、 测序反应纯化、 毛细管电泳和 数据分析。 其中循环测序反应需要根据不同P CR扩增产 物添加低浓度的单向扩增引物， 不仅 增加了Sanger测序的工作量， 也增 加了引物加错的可能性。 发明内容 [0004]为此， 需要提供一种基于加尾引物设计的Sanger测序方法， 解决现有Sanger测序 的工作量大， 引物可能加错的问题。 [0005]为实现上述目的， 本发明提供了一种基于加尾引物设计的Sanger测序方法， 包括 如下步骤： [0006](1)根据样本D NA选择特异性引物序列， 之后在特异性引物序列的5 ’端加上通用引 物序列得到加尾引物序列， 最后根据加尾引物序列合成加尾引物； [0007](2)使用加尾引物配制PCR扩增反应液， 之后加入样本DNA得到PCR扩增反应体系， 之后执行PCR扩增程序， 得到PCR扩增产物； [0008](3)使用虾碱 酶与外切酶配置 成消化液， PC R扩增产物离心后， 将消化液加入PC R反 应液中进行， 反应得到纯化的PCR扩增产物； [0009](4)选择正向或反向通用 引物作为测 序引物,对纯化的PC R扩增产物进行循环测序 反应； [0010](5)循环测序反应产物经 过纯化、 变性、 上机测序得到样本DNA的序列。 [0011]上述技术方案具有以下有益效果： [0012](1)通过在PC R扩增特异性引物的5 ’端添加通用序列， 经PCR扩增之后， 使用通用序 列的引物进 行循环测序反应， 实现不同P CR扩增产 物使用相同的引物进 行循环测序反应。 不说　明　书 1/10 页 3 CN 114703267 A 3