(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210355033.2 (22)申请日 2022.04.06 (71)申请人 南京邮电大 学 地址 210046 江苏省南京市栖霞区文苑路9 号 (72)发明人 张峻诚　吴鸿宇　朱丹　汪联辉　 晁洁　 (74)专利代理 机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 专利代理师 强萌 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携 试剂盒及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于病毒核酸检测的荧 光可视化便携试剂盒及其制备方法和应用， 该试 剂盒包括磁性检测探针和DNA扩增元件F 1、 F2； 所 述磁性检测探针包括磁颗粒， 磁颗粒表面修饰有 DNA锚定链P1， DNA探针链L1、 L2、 L3及DNA荧光链 R1； L1和L2的序列分别 与两段待测病毒核 酸特征 序列T1、 T2互补； P1的序列与L1的序列部分 互补； L1上杂交有 荧光修饰的序列R1以及L2； L2与L3的 序列部分互补； F1和F2可以在T1、 T2同时存在时 打开杂交体， 释放出荧光链R1， 指示体系中待测 病毒核酸特征序列T1、 T2 的同时存在。 本发明的 试剂盒无需PCR扩增， 仅用荧光激发灯便可以方 便地检测病毒， 节约诊断时间。 权利要求书2页 说明书7页 序列表3页 附图5页 CN 114752705 A 2022.07.15 CN 114752705 A 1.一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒， 其特征在于， 包括磁性检测探针 和DNA扩增元件F1、 F2； 所述磁性检测探针包括磁颗粒， 所述磁颗粒表面修饰有DNA锚定链 P1， DNA探针链L1、 L2、 L3及DNA荧 光链R1； 所述L1和L2的序列分别与两段待测病毒 核酸特征序列T1、 T2互补； 所述P1一端连有生物素或氨基， 可以使DNA锚定链连接到亲和素或羧基修饰的磁珠上， P1的序列 与L1的序列部分互补； 所述L1上杂交有荧光修饰的序列R1以及L2， 并且L1的序列与 一段待测病毒核酸特征序 列T1部分互补； 所述L2与 L3的序列部分互补， 并且L2的序列与另一段待测病毒核酸特征序列T2部分互 补； 所述F1与L1的序列部分互补； 所述F2与L2的序列部分互补； 所述F1和F2可以在T 1、 T2同时存在时打开P1/L1/L2/L3/R1的杂交体， 释放出荧光链R1， 指示体系中待测病毒核酸特征序列T1、 T2的同时存在； 在此过程中释放出T1、 T2进 行循环利 用， 实现信号扩增。 2.根据权利要求1所述的一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒， 其特征在 于， 所述R1所修饰的荧光为近红外二区荧光分子、 上转换粒子、 量子点、 罗丹明、 花菁染料、 金纳米簇、 含芳 香烃/杂环结构的荧 光团中的一种。 3.根据权利要求1所述的一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒， 其特征在 于， 还包括待测病毒核酸阳性检测样本和Tris缓冲液； 所述待测病毒核酸阳性检测样本包 括特征序列T1、 T2。 4.根据权利要求3所述的一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒， 其特征在 于， 所述T1、 T2包括但不限于SARS ‑CoV‑2N基因片段、 SARS ‑CoV‑2E基因片段， 以及 ORF1ab特 征基因片段。 5.根据权利要求1所述的一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒， 其特征在 于， 所述待测病毒为SARS ‑CoV‑2； 所述P1具有如SEQ  ID No.1所示的序列； 所述L1具有如SEQ  ID No.2所示的序列； 所述L2具有如SEQ  ID No.3所示的序列； 所述L3具有如SEQ  ID No.4所示的序列； 所述R1具有如SEQ  ID No.5所示的序列； 所述F1具有如SEQ  ID No.6所示的序列； 所述F2具有如SEQ  ID No.7所示的序列； 所述T1为SARS ‑CoV‑2N基因片段， 具有如SEQ  ID No.8所示的序列； 所述T2为SARS ‑CoV‑2E基因片段， 具有如SEQ  ID No.9所示的序列。 6.根据权利要求1所述的一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒， 其特征在 于， 所述磁颗粒 是由链霉亲和素或羧基包覆的， 其粒径为10nm～ 2 μm。 7.权利要求1所述的一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒的制备方法， 其 特征在于， 包括以下步骤： (1)将DNA锚定链P1通过生物素 ‑链霉亲和素作用或氨羧缩合作用组装到磁颗粒的表权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114752705 A 2面； 通过磁分离去除多余的DNA锚定链， 并对组装后的磁颗粒进行清洗和重新分散； (2)向步骤(1)得到的磁颗粒中加入DNA探针链L1、 L2、 L3和DNA荧光链， 在磁颗粒表面形 成杂交结构； 通过磁分离去除多余的DNA探针链和DNA 荧光链并对组装后的磁颗粒进 行清洗 和重新分散， 组装成磁性检测探针； (3)向步骤(2)得到的磁颗粒中加入DNA扩增元件F1、 F2， 即得。 8.根据权利要求7所述的一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒的制备方 法， 其特征在于， 步骤(1)所述将DNA锚定链P1通过生物素 ‑链霉亲和素作用或氨羧缩合作用 组装到磁颗粒的表面的具体步骤为以下两种方案之一： (a)将生物素化的DNA锚定链和链霉 亲和素修饰的磁颗粒混合， 并对组装后的磁颗粒进行清洗， 去除多余的DNA锚定链， 将得到 的磁颗粒分散在Tris缓冲液中储 存； 所述Tris缓冲液为： 50mM  Tris‑HCl， 140mM  NaCl， 1mM MgCl2， pH＝7.4； (b)将羧基修饰 的磁颗粒稀释在MES缓冲液中， 继续加入体积比例为2:1的EDC缓冲液和NHS缓冲液， 并在45 ℃下反应6h， 随后用PBS缓冲液洗涤三次， 加入基修饰的DNA锚定链， 并在37℃下孵育1h， 反 应完之后得到的磁颗粒分散在PBS缓冲液中； 所述MES缓冲液为： 10 0mM MES， pH＝6.0； 所述EDC缓冲液为： 100mM  MES， 200mM  EDC， pH＝6.0； 所述NHS缓冲液为： 100mM  MES， 100mM NHS， pH＝6.0； 所述PBS缓冲液为： 10mM  PBS， pH＝7.2。 9.根据权利要求7所述的一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒的制备方 法， 其特征在于， 步骤( 1)所述DNA锚定链P1是由生物素或氨基修饰的， P1的浓度为10～ 5000nM； 步骤(2)所述DNA探针链L1、 L2均与目标核酸部分互补， L1、 L2、 L3的浓度均为10～ 5000nM； 步骤(3)所述DNA扩增元件F1、 F2可催化等温核酸扩增反应的进行， F1、 F2的浓度均 为10～5000nM。 10.根据权利要求9所述的一种用于病毒核酸检测的荧光可视化便携试剂盒的制备方 法， 其特征在于， 步骤(1)所述P 1的浓度为500nM； 步骤(2)所述L1、 L2、 L3的浓度均为750nM； 步骤(3)所述F1、 F2的浓度均为125 0nM。 11.权利要求1 ‑6任一项所述的试剂盒、 或权利要求7 ‑10任一项所述制备方法制得的试 剂盒在SARS ‑CoV‑2核酸检测中的应用。 12.根据权利要求1 1所述的应用， 其特 征在于， 检测方法包括以下步骤： 向所述磁性检测探针中加入目标核酸， 在20～45℃下反应10～120min进行等温核酸扩 增反应， 再通过磁 分离， 收集上清液； 上清液在荧光激发灯的照射下， 发出荧光则为阳性， 不 发荧光则为阴性。 13.根据权利要求12所述的应用， 其特征在于， 所述等温核酸扩增反应的反应温度为37 ℃， 反应时间为75mi n。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114752705 A 3