(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210357338.7 (22)申请日 2022.04.06 (71)申请人 杭州杰毅医学检验实验室有限公司 地址 311112 浙江省杭州市余杭区良渚街 道金昌路2073号3号楼10 3室、 103-1室 (72)发明人 刘超　欧阳川　李彩云　石瑛琪　 王珺　 (74)专利代理 机构 浙江千克知识产权代理有限 公司 33246 专利代理师 黎双华 (51)Int.Cl. C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种内参、 包 含有该内参的试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明属于生物技术领域， 涉及一种内参、 包含有该内参的试剂盒及其应用， 该内参的核酸 序列如SEQ  ID NO.1所示， 用于对标本中微生物 进行定了， 并结合大数据统计分析， 对微生物的 定值与感 染进行判定 。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 114703266 A 2022.07.05 CN 114703266 A 1.一种内参， 其特 征在于， 所述内参的核酸序列如SEQ  ID NO.1所示。 2.一种试剂盒， 其特 征在于， 包 含有如权利要求1所述的内参。 3.如权利要求1所述的一种内参或者如权利要求2所述的试剂 盒的应用， 用于标本 中微 生物的定量。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 利用所述定量的结果结合大数据统计， 对 标本中微 生物定植与感染进行判定 。 5.一种微生物定值与感染的判定方法， 其特征在于， 采用如权利要求1所述的内参或者 采用如权利要求2所述的试剂盒， 包括如下步骤： S‑1. 合成如SEQ  ID NO.1所示的内参核酸； S‑2. 对内参核酸进行扩增、 纯化、 定量， 得到1ng 内参核酸的精确分子数； S‑3.在待测临床标本进行核酸提取前加入内参核酸， 使得相同类型标本中的内参核酸 摩尔数保持一 致； S‑4.对加入内参核酸的待测临床标本进行宏基因 组文库构建， 进行高通 量测序； S‑5.对高通量测序结果进行比对分析， 得到内参核酸每百万条序列中的测序读长数 （reads per million， RPM， ） RPM 内参， 人源序列RPM宿主， 以及不同病原微生物的RPM病原， 当RPM内参  > 0时， 计算Index宿主  = Log2 （RPM宿主/  RPM内参） *  1000， Index病原=  Log2 （RPM病原/  RPM内参） *  1000； S‑6.采用S‑1至S‑5步骤所描述的方法， 对同类型的一批临床标本开展宏基因组学检 测； 临床标本来源于两个分组： 定植组与感染组， 统计不同分组中， 某种 条件致病微生物的 Index数值； S‑7.对定植组与感染组中条件致病微生物的Index数值绘制ROC曲线与PR曲线， 在最佳 的约登指数时获取目标微 生物定植与感染的I ndex阈值。 6.根据权利要求5所述的微生物定值与感染的判定方法， 其特征在于， 在所述Index阈 值下计算曲线下面积， AUC大于等于0.8， 否则需要在定植组与 感染组中持续入组患者直至 AUC大于等于 0.8。 7.根据权利要求5所述的微生物定值与感染的判定方法， 其特征在于， 步骤S ‑4中， 高通 量测序数据量应不低于10 00万条序列。 8.根据权利要求5所述的微生物定值与感染的判定方法， 其特征在于， 步骤S ‑2中内参 的定量采用Qubit荧 光定量或数字PCR定量。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114703266 A 2一种内参、 包含有该内参的试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技 术领域， 涉及一种内参、 包 含有该内参的试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]及时准确发现病原体对于感染性疾病的诊断和治疗意义重大。 传统微生物学检验 技术， 诸如培养、 生化鉴定、 质谱等方法在厌氧、 苛养微生物上存在较大局限性； 而抗体/抗 原， PCR等靶向检测难以广泛覆盖所有潜在的病原微生物， 尤其是罕见、 新发病原体。 2014 年， 加州大学旧金山分校 （UCSF） 的Charles  Chiu团队首次采用高通量测序技术 （NGS， Next   Generation  Sequencing） 成功地对一位患有联合免疫缺陷综合征， 由钩端螺旋体 （Leptospira） 引起脑膜炎的临床患者提供病原学诊断和针对性治疗， 随后， 针对病原微生 物的metagenomic  Next Generation  Sequencing （mNGS） ， 也称为鸟枪法宏基因组测序 （shotgun  metageno mic sequencing） 检测技术逐渐在临床广泛应用， 尤其是针对免疫抑制 感染患者的鉴别诊断。 mNGS由湿实验和干实验两个部分组成， 湿实验流程一般包含微生物 破壁、 核酸提取、 逆转录 （对RNA测序） 、 核酸片段化、 文库构建、 文库定量、 等量混合与上机测 序， 干实验流程一般包含测序数据质控、 人源序列过滤、 微生物数据库比对、 种属鉴定与丰 度计算等环节。 mNGS具有 不需培养 （cu lture‑free） 、 不依赖 前提假设 （hypot hesis‑free） 两 大优势， 可以在一次检测中覆盖所有已知基因序列的病原 微生物， 对于 疑难危重、 经验性抗 生素治疗无效的感染患者， 以及罕见、 新发病原体感染的诊断上 具有很大应用价 值。 [0003]鸟枪法宏基因组测序对临床样本中提取的总核酸进行无偏倚的鸟枪法测 序， 汇报 微生物的序列数 （reads） 或根据测序数据量标化后的序列数 （RPM， reads  per million  reads， 相对于每百万条序列的数值） 。 因为无偏倚特性， 理论上可以检测所有已知基因序列 的微生物， 具有常规方法所不具备 的广覆盖优点。 但正是 由于这种 无偏好性的等比例抽样 （unbiased  proportional  sampling） ， 最终测序获得的片段只占文库中真实核酸片段的千 分之一甚至更低， 因此mNGS对微生物的检测性能取决于两个因素： 人源核酸含量与病原核 酸含量： 人源核酸含量越高， 微生物的检测性能越差。 在人源核酸含量高的样本中， 绝对载 量相同的微生物的reads数或RPM会低于人源核酸含量低的样本。 因此单纯通过reads数或 RPM并不能反应微生物的载量高低。 此外， 大量病原微生物属于条件致病微生物， 既可能造 成感染， 也可能是无症状的携带或定植。 定植 或感染与很多因素相关， 比如微生物本身的载 量 （载量越高， 造成感染的机率越大） ， 微生物的毒力 （毒力越高， 感染几率越大） ， 宿主的免 疫状态 （在免疫抑制宿主中更有可能造成感染） 等等。 因此， 如果可以通过mNGS对标本中的 病原微生物进 行定量检测， 可以结合宿 主的免疫状态对其定植或感染的状态进行更好的评 估和诊断。 发明内容 [0004]本发明的第一目的是提供一种内参， 应用于宏基因组测序对微生物进行定量， 通 过内参核酸的测序结果反映检测的灵敏度， 降低外源核酸载量对测序结果 准确性的影响。说　明　书 1/6 页 3 CN 114703266 A 3