(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210351281.X (22)申请日 2022.04.02 (66)本国优先权数据 202111111154.4 2021.09.23 CN (71)申请人 北京市农林科 学院 地址 100097 北京市海淀区曙光 花园中路9 号 (72)发明人 孙惠玲　霍彩云　李桂萍　 (74)专利代理 机构 北京智为时代知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11498 专利代理师 王加岭　杨静 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01)G01N 33/53(2006.01) G01N 33/558(2006.01) G01N 33/548(2006.01) G01N 33/58(2006.01) G01N 33/532(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种快速、 灵敏检测副鸡禽杆菌核酸的横向 流动检测试剂、 方法 (57)摘要 本发明提供了一种快速、 灵敏检测副鸡禽杆 菌核酸的横向流动检测试剂、 方法。 提供了一种 快速、 灵敏检测副鸡禽杆菌核酸的引物， 其包括 如SEQ IDNO.1和SEQ  ID NO.2所示的序列或反向 序列， 利用该引物进行扩增后并将扩增产物进行 琼脂糖凝胶电泳或试纸条进行检测。 本发明提供 的方法能快速、 准确地测定副鸡禽杆菌的核酸。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图5页 CN 115029456 A 2022.09.09 CN 115029456 A 1.一种快速、 灵敏检测副鸡禽杆菌核酸的引 物， 其特征在于， 其包括如SEQ  ID NO.1和 SEQ ID NO.2所示的序列或反向序列。 2.一种快速、 灵敏检测副鸡禽杆菌核酸的横向流动检测试剂， 其特征在于， 其包括权利 要求1所述的检测副鸡禽杆菌核酸的引物和检测条， 其中， SEQ  ID NO.1所示序列的5 ′端标 记生物素， SEQ  ID NO.2所示序列的5 ′端标记地高辛， 所述检测条包括次序叠加组装在垫板 上的样品垫、 共轭垫、 硝酸硝酸纤维素膜和吸收垫， 其中， 所述硝酸纤维素膜上的检测线包 被有山羊抗生物素抗体， 质控线包被有山 羊抗小鼠IgG抗体， 共轭垫上包被有小鼠抗地高辛 抗体偶联的纳米金抗体偶联物。 3.如权利要求2所述的横向流动检测试剂， 其特征在于， 所述检测线包被的山羊抗生物 素抗体的浓度为1mg/mL， 所述质控线包被的山羊抗小鼠IgG抗体的浓度为2mg/mL。 4.如权利要求3所述的横向流动检测试剂， 其特征在于， 所述纳米金抗体偶联物的制备 方法， 包括采用柠檬酸三钠法制备的纳米金颗粒， 用碳酸钾调节纳米金颗粒溶液的pH值， 加 入小鼠抗地高辛抗体进行标记， 之后再加入20％BSA进行封闭， 搅拌后， 离心获得纳米金抗 体偶联物， 加入偶联稀释缓冲液进行重悬。 5.如权利要求4所述的横向流动检测试剂， 其特征在于， 所述纳米金颗粒的粒径为 25nm， pH值 为8.0； 样品垫上包被有3％的BSA。 6.一种快速、 灵敏检测副鸡禽杆菌核酸的横向流动检测方法， 其特征在于， 其包括如下 步骤： (1)提取样品的DNA， (2)采用引物对如SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2所示的序列对提取 的DNA进行PCR扩增， SEQ ID NO.1所示序列的5 ′端标记生物素， SEQ  ID NO.2所示序列的5 ′端标记地高辛； (3)将步骤(2)获得的PCR扩增产物用电泳方法或核酸检测条进行 结果判定 。 7.如权利要求6所述的横向流动检测方法， 其特征在于， 在步骤(2)中， 所述PCR扩增的 体系中包 括终浓度为1xTaq  PCR Mix， 引物对SEQ  ID NO.1和SEQ  ID NO.2的浓度分别为0.2 μmol/L。 8.如权利要求6所述的横向流动检测方法， 其特征在于， 在步骤(2)中， 所述PCR反应条 件为： 94℃5mi n； 94℃30s， 55℃30s， 72℃2mi n， 35个循环； 72℃10mi n。 9.如权利要求6所述的横向流动 检测方法， 其特征在于， 在步骤(3)中， 电泳方法判定结 果： 若有507bp的条 带说明检测结果 为阳性， 否则为阴性。 10.如权利要求6所述的横向流动检测方法， 其特征在于， 在步骤(3)中， 检测条判定结 果： 当检测线 T线和质控线C线均显色时， 说明样品中含副鸡禽杆菌的核酸成分； 当检测线T线不显色、 质控线C线显色时， 说明样品中不含副鸡禽杆菌的核酸； 当质控线 C线不显色时， 说明操作不当应重新检测或试纸条已经失效。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115029456 A 2一种快速、 灵敏检测副鸡禽杆菌核酸 的横向流动检测试剂、 方法 技术领域 [0001]本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及一种快速、 灵敏检测副鸡禽杆  菌核酸的 新型横向流动检测试剂、 方法。 背景技术 [0002]鸡传染性鼻炎是由副鸡禽杆菌引起的一种鸡急性上呼吸道传染病。 目前  该病在 世界许多地方都有发生和流行， 给养禽业造成很大的经济损失。 根据  Page和Kume血清分型 方案， 可将副鸡禽杆菌分为3个血清群(A、 B、 C)和  9个血清型(A1 ‑A4、 B‑1和C1‑C4)。 该病最 常见的临床特征是打喷嚏、 眶下  窦肿胀、 面部水肿及结膜炎、 鼻分泌物， 并伴有生长迟缓和 产蛋量减少， 这  与养禽业的经济效益密切相关。 因此， 急需开发可靠的检测工具以便于在 感 染早期进行诊断干预， 从而减少经济损失。 [0003]目前， 已有较多的副鸡禽杆菌的检测 方法， 如ELISA等血清学检测 方 法以及传统 PCR和实时荧光定量P CR等核酸检测方法。 然而， 一些技术困  难和挑战阻碍了这些方法的广 泛使用。 例如， 虽然ELISA是一种众所周知的  高通量细菌检测技术， 但它 也有一些缺点， 包 括需要高度特异 性和敏感性的  抗体、 耗时、 繁琐的洗涤和培养步骤。 因此， 该方法不能被认 为是一种广泛  应用于副鸡禽杆菌的有效方法。 [0004]与常规血清学检测相比， 核酸检测技术具有灵敏度高、 特异性强的特点，  在缩短 检测时间、 提高病原体检出率方面具有较大的优势。 目前常用的核酸  检测技术是传统P CR， 该技术获得的扩增产 物是根据特定条带的大小通过琼  脂糖凝胶电泳初步确定的。 然而， 一 些缺陷也制约了传统PCR方法 的进一步  应用。 例如耗时、 繁琐、 容易产生污染。 随着分子生 物学技术的不断发展，  各种基于PCR的技术不断发展， 尤其是RT ‑qPCR的发明， 为整个分子 诊断 行业带来了新的活力。 该技术具有灵敏度和特异性高的特点， 同时需要完善  的基础 设施和经验丰富的操作人员， 因此该方法难以推广。 因此， 开 发一种 新型的、 灵敏、 快速、 低 成本、 高通量的副鸡禽杆菌核酸检测技术用于副鸡  禽杆菌的早期诊断， 对于控制其进一步 传播具有重要意 义。 [0005]横向流动分析(LFA)是一种快速、 灵敏的检测方法， 具有 分析成本低、  快速、 灵敏、 操作简单、 不需要复杂的基础设施和经验丰富的操作人员等优  点， 已广泛应用于各个领 域。 作为一种新型的免疫标记 技术， 纳米金颗粒在  该技术中常用作为应用于抗原和抗体的 微量标记物。 通过设计夹层结构的  LFA条带， LFA方法在病毒、 细菌、 寄生虫抗原、 小分子药 物等检测中具有  重要的应用价值。 例如， 它可以用来评估不同样品中的毒素， 而无需繁琐 的 操作。 在禽类病原体方面， 该方法可以检测流 感病毒、 新城疫病毒、 禽白血  病病毒等。 但 这些例子大多以抗体检测或小分子检测为主， 基于LFA的核酸  检测还需要进一步 发展和完 善。说　明　书 1/6 页 3 CN 115029456 A 3