(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210353821.8 (22)申请日 2022.04.02 (71)申请人 西北大学 地址 710069 陕西省西安市太白北路2 29号 申请人 秦岭大熊猫 研究中心 （陕西省珍稀 野生动物救护基地） (72)发明人 郭松涛　吴帆　雷颖虎　高更更　 贾康胜　陈国梁　刘佳　王梓　 杨佳宜　 (74)专利代理 机构 西安智邦专利商标代理有限 公司 6121 1 专利代理师 汪海艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法、 位点组合及引物组合、 试剂盒与应用 (57)摘要 本发明公开一种用于川金丝猴个体示踪的 微卫星检测方法、 位点组合及引物组合、 试剂盒 与应用， 克服利用现有 方法无法实现川金丝猴个 体示踪的难题。 首先确定21对微卫星位点组合， 核心重复序列为四碱基重复， 重复序列重复次数 在8次以上， 产物在100 ‑300bp， 根据21对微卫星 位点组合合成相应微卫星位点引物； 之后根据合 成的相应微卫星引物组合及川金丝猴个体的基 因组DNA， 进行PCR扩增反应， 获得扩增产物； 最后 利用毛细管电泳检测方法， 检测扩增产物的微卫 星多态性； 分析检测结果， 对比基因型， 进行个体 鉴定。 精确度达到99.999％， 具有快速、 准确、 简 便和实现成本 较低的优点。 权利要求书3页 说明书8页 序列表7页 附图2页 CN 114703294 A 2022.07.05 CN 114703294 A 1.一种用于川金丝猴个 体示踪的微 卫星检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤1、 确定21对微卫星位点组合， 核心重复序列为四碱基重复， 重复序列重复次数在8 次以上， 产物在10 0‑300bp， 根据21对微 卫星位点组合合成相应微 卫星位点引物； 步骤2、 提取川金丝猴个 体的基因 组DNA； 步骤3、 利用步骤1合成的相应微卫星引物组合及步骤2提取的川金丝猴个体的基因组 DNA， 进行PCR扩增反应， 获得扩增产物； 步骤4、 利用毛细管电泳检测方法， 检测扩增产物的微 卫星多态性； 步骤5、 分析检测结果， 对比基因型， 进行个 体鉴定。 2.根据权利要求1所述的用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法， 其特征在于， 所述 步骤1中21对微 卫星位点组合分别为： GSM ‑1至GSM‑21； 相应微卫星引物组合的序列如下： 3.根据权利要求1或2所述的用于川 金丝猴个体示踪的微卫星检测方法， 其特征在于， 步骤2具体为： 提取川金丝猴个 体的基因 组DNA提取的是抗凝血DNA、 毛发DNA或粪便DNA。 4.根据权利要求3所述的用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法， 其特征在于， 步骤 3PCR反应 体系按10 μl计， 具体为：权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114703294 A 25.根据权利要求4所述的用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法， 其特征在于， 21对 微卫星位点引物组合PCR程序为： 95℃变性， 4min； 94℃变性， 1min； 设置不同位点的退火温 度， 在该温度下复性45s； 72℃延伸45s； 循环35次； 72℃延伸10min； 4℃延伸； 21对微卫星位 点引物退火温度如下 所示： 引物 退火温度(℃) 引物 退火温度(℃) GSM‑1 54 GSM‑11 53 GSM‑2 56 GSM‑12 55 GSM‑3 54 GSM‑13 61 GSM‑4 53 GSM‑14 60 GSM‑5 55 GSM‑15 60 GSM‑6 61 GSM‑16 61 GSM‑7 60 GSM‑17 60 GSM‑8 61 GSM‑18 60 GSM‑9 52 GSM‑21 58 GSM‑10 58 GSM‑20 54 GSM‑21 61 。 6.根据权利要求5所述的用于川金丝猴个体示踪的微卫星检测方法， 其特征在于， 步骤 5通过Gene  Mapper ID V3.2软件获取基因型数据， 使用Cervus  3.0中的Identity   analysis程序对所有分型个 体进行个 体鉴定。 7.一种用于川 金丝猴个体示踪的微卫星位点组合及引物组合， 其特征在于： 包括21对 微卫星位点组合分别为： GSM ‑1至GSM‑21； 相应微卫星引物组合的序列如下：权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114703294 A 3