(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210351201.0 (22)申请日 2022.04.02 (71)申请人 予果生物科技 （北京） 有限公司 地址 102600 北京市大兴区北京经济技 术 开发区地盛东路1号院6号楼5 01室 申请人 西咸新区予果 微码生物科技有限公 司　 予果智造科技 （北京） 有限公司 (72)发明人 夏涵　官远林　刘梦迪　江月　 王建民　李长诚　 (74)专利代理 机构 西安鼎迈知识产权代理事务 所(普通合伙) 6126 3 专利代理师 李振瑞 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/6869(2018.01) C12Q 1/6811(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C40B 50/06(2006.01) G16B 30/00(2019.01) G16B 40/00(2019.01) C12R 1/32(2006.01) (54)发明名称 检测宏基因组中结核分枝杆菌的引物组及 高通量测序方法 (57)摘要 本发明提供了一种检测宏基因组中结核分 枝杆菌的引物组， 所述引物组包括至少36对引物 组， 每对所述引物对由正向引物与反向引物组 成， 所述引物对选自SEQIDN O： 1～72所示核苷酸； 所述核苷酸是结核分枝杆菌特异性基因IS6110 引物组。 本发 明提供的检测宏基因组中结核分枝 杆菌的引物组及高通量测序方法能够快速高效 设计特异性引物， 为鉴定出整个基因或者基因组 的变异情况提供了高效方法。 本发 明的方法相较 于传统mN GS方法， 提高了 结核分枝杆菌的检测灵 敏度80倍以上。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 114574606 A 2022.06.03 CN 114574606 A 1.一种检测宏基因组中结核分枝杆菌的引物组， 其特征在于， 所述引物组包括至少36 对引物组， 每对 所述引物对由正向引物与反向引物组成， 所述引物对选自SEQ  ID NO： 1～72 所示核苷酸； 所述核苷酸是 结核分枝杆菌特异性基因IS61 10特异性引物组。 2.一种用于检测宏基因组中结核分枝杆菌的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权 利要求1所述的引物组。 3.一种检测宏基因组中结核分枝杆菌高通量测序方法， 其特征在于， 所述高通量测序 方法包括结核分枝杆菌特异性基因IS6110特异性引物组高通量设计方法和基于mNGS检测 结核分枝杆菌的建库方法； 所述结核分枝 杆菌特异 性基因IS6110特异 性引物组高通量设计 方法包括下 载基因组、 获取IS61 10序列、 高通 量设计候选引物组和引物筛 选。 4.根据权利要求3所述的一种检测宏基因组中结核分枝杆菌高通量测序方法， 其特征 在于， 所述结核分枝杆菌特异性基因IS61 10特异性引物组高通 量设计方法包括如下步骤： (1)下载基因组： 从基因组数据库下载结核分枝杆菌 的M1个基因组序列； 所述100<M1< 7000； (2)获取IS6110序列： 从下载的结核分枝杆菌基因组中利用同源比对获取IS6110序列， 并将这些序列用MUSCLE进行多重比对； (3)高通量设计候选引物组： 将匹配好的多重基因组序列分割成有150 ‑300nt重叠的 300‑500nt片段， 在每个片段两端截取30 ‑60nt作为引物设计区域， 针对该引物设计区域遍 历设计多个13～25nt的正向或者反向引物， 组成该基因待合并引物组； 将每个区域的合并 引物组的所有引物按照出现频率排序， 选择出现频率最高且不含不确定碱基的引物， 删除 与该引物序列相同的所有引物， 对剩余的引物再次进 行排序筛选， 重复M2次后， 得到候选引 物组； 所述2< M2<10； (4)引物筛选： 对候选引物组经过二次筛选， 删除以下任意或者多个情况的引物： Tm值 与平均值偏离达到2个标准差以上、 可能形成自身二聚体或者交叉二聚体、 存在5个以上 的 均聚物重复碱基， 经 过筛选后剔除得到最终多重基因引物组。 5.根据权利要求4所述的一种检测宏基因组中结核分枝杆菌高通量测序方法， 其特征 在于， 所述高通量设计候选引物组是将匹配好的多重基因组序列分割成有200nt重叠的 400nt片段， 在每个片段两端截 取50nt作为引物设计区域， 针对 该引物设计区域遍历设计多 个15nt的正向或者反向引物， 组成该基因待合并引物组。 6.根据权利要求3所述的一种检测宏基因组中结核分枝杆菌高通量测序方法， 其特征 在于， 所述基于mNGS检测结核分枝杆菌的建库方法包括如下步骤： (1)多重基因特异性引物组制备步骤： 设计并筛 选多重基因特异性引物步骤； (2)PCR扩增： 利用设计的多重基因特异性引物组进行多重PCR扩增； (3)文库构建： 对多重PCR产物进行文库构建； (4)二代上机测序； (5)数据分析与结果 解读。 7.一种非诊断目的的检测结核分枝杆菌的方法， 其特征在于， 所述方法包括对权利要 求6得到的测序文库进行高通量测序获得测序数据， 然后对所述测序数据进行分析以获取 结核分枝杆菌检测结果。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574606 A 2检测宏基因组中 结核分枝杆菌的引物组及 高通量测序方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物技 术领域， 涉及一种检测结核分枝杆菌的高通 量测序的方法。 背景技术 [0002]结核分枝 杆菌复合群(M ycobacter ium tuberculosis  complex， MTBC)是引起结核 病(TB)的致病菌， 作为传染性疾病， 通过患有活动性呼吸系统疾病的人的喉咙和肺部的飞 沫在人与人之间传播的。 流行病 学研究发现， 肺结核仍然是一种严重威胁人类健康的传染 性疾病， 特别是在中低收入国家。 全球每年新增结核病例约有1000万例， 其中死亡人数约有 150万。 [0003]据WHO报告， 2019年全球新发结核病约1000万例， 约140万人死亡。 而且结核病经常 在学校等人员聚集地方发生并快速传播， 加之结核分枝杆菌的耐药问题比较突出， 患者医 疗负担较重， 防治任务十 分艰巨。 加大筛查力度， 提高肺结核患者病原学阳性比例和治疗成 功率， 是解决结核病防治的关键 。 [0004]目前仍有大量的结核分枝杆菌感染者由于缺乏病原学依据， 使得临床诊断变得极 为困难， 而且很容易造成漏诊和误诊， 从而导致结核病的广泛传播。 传统方法学上， 抗酸染 色镜检和实验室培养是结核病原学检测 最常用的方法， 但总体上检出率较低， 而且非常耗 时耗力。 近年来随着分子生物学和生物技术的发展， 基于核酸扩增的检测技术不断涌现， 如 实时定量PCR、 环介导等温扩增技术以及宏基因组测序(metagenomic  next‑generation   sequencing， mNGS)， 均具有快速、 灵敏的特点， 已被广泛使用以确定临床样 本中结核分枝 杆 菌的存在。 [0005]近几年， 精准医学在病原诊断方面也势头渐起。 从1995年完成第一株流感嗜血杆 菌全基因组测序后， 当代医学对病原的基因研究如雨后春笋般涌现， 对病原基因的认识也 有了突飞猛进的进展。 mNGS检测可以直接对临床标本中全部微生物的核酸进行高通量测 序， 通过微生物专用数据库比对和智能化算法分析， 获得疑似致病微生物的种属信息， 无偏 性的检测细菌、 真菌、 病毒、 寄生虫等各种病原体。 然而， 根据最新基因组学研究发现， 这些 诊断技术仍然存在 诸多问题如灵敏度不 足、 不能鉴定出整个基因或者基因组的变异情况等 问题。 发明内容 [0006]针对上述内容中所记载的技术问题中的一种， 本发明提出了一种检测宏基因组中 结核分枝杆菌的引物组及高通量测序方法， 通过本发明的高通量引物设计方法能够获得多 重基因特异性引物组， 并设置基于mNGS检测结核分枝杆菌的建库方法， 提高了结核分枝杆 菌检测的灵敏性， 而且能够鉴定出整个 基因组。 [0007]第一方面， 本发明提供了一种检测宏基因组中结核分枝杆菌 的引物组， 所述引 物 组包括至少36对引物组， 每对 所述引物对由正向引物与反向引物组成， 所述引物对选自S EQ  ID NO： 1～72所示核苷酸； 所述核苷酸是 结核分枝杆菌特异性基因IS61 10特异性引物组。说　明　书 1/6 页 3 CN 114574606 A 3