(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210345627.5 (22)申请日 2022.04.02 (71)申请人 山东省滨州畜牧兽医研究院 地址 256600 山东省滨州市滨 城区黄河二 路169号绿都生物工程高科技园 (72)发明人 于新友　王文秀　李天芝　谢金文　 李峰　唐娜　 (74)专利代理 机构 重庆航图知识产权代理事务 所(普通合伙) 50247 专利代理师 王贵君 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/42(2006.01)C12R 1/35(2006.01) (54)发明名称 检测鸡肠炎沙门 氏菌和滑液囊支原体的双 重荧光PCR引物组和试剂盒及方法 (57)摘要 本发明公开了一种检测鸡肠炎沙门 氏菌和 滑液囊支原 体的双重荧光PCR引物组和试剂盒及 方法， 本发 明提供的引物组包括针对鸡肠炎沙门 氏菌和滑液支原 体的特异性引物， 所有引物长度 均20个碱基左右， GC含量在40％～60％， 引物间 无互补序列， 熔解温度相差小于5℃， 引物内无互 补序列及二级结构。 本发明提供的试剂盒同时含 有鸡肠炎沙门氏菌和滑液支原 体的引物组， 扩增 时4条引物之间不互相干扰， 使用本发明试剂盒 一次扩增反应， 可完成两种病原筛查， 有效克服 了现有试剂盒不能同时检测鸡肠炎沙门氏菌和 滑液支原 体的弊端， 为鸡场鸡肠炎沙门氏菌病和 滑液支原体病两种疾病的净化提供了强有力的 技术支撑， 具有较高的实用价值和广阔的应用前 景。 权利要求书2页 说明书7页 序列表4页 附图3页 CN 114574605 A 2022.06.03 CN 114574605 A 1.一种检测鸡肠炎沙门氏菌和滑液囊支原体的双重荧光PCR引物 组， 其特征在于， 所述 引物组包括引物组包括针对鸡肠炎沙门氏菌的特异性引物、 针对滑液支原体的特异性引 物； 所述针对鸡肠炎沙门氏菌的特异性引物包含： 如SEQ  ID NO.1所示的第一正向引物， 特 定碱基序列为： GGGCTTCGGTATCTGGTG； 如SEQ  ID NO.2所示的第一反 向引物， 特定碱基序列 为： GGGACATTTAGCGTTTCTT； 所述针对滑液支原体的特异性引物包含： 如SEQ  ID NO.3所示的第二正向引物， 特定碱 基序列为： AAGGTCTTGTAATGCGAGTG； 如SEQ  ID NO.4所示的第二反向引物， 特定碱基序列为： TTGCGTTGTTGTTGGAG。 2.包含权利要求1所述的引物组的试剂盒。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括： 包括PCR反应液A、 PCR 反应液B、 阳性对照品、 阴性对照品和核酸释放剂； 所述PCR反应液A 包含： Green Pro Taq HS Premix和无核酸酶水混合组成， 含 MgCl2、 dNTP、 SYBR  GreenⅠ和Taq酶成分； 所述PCR反应液B为权利要求1所述的引物组。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述PCR反应液B中第一正向引物、 第一 反向引物、 第二 正向引物、 第二反向引物的摩尔比为1.2： 1.5： 0.8： 0.7。 5.根据权利 要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述阳性对照品为含有SEQ  ID NO.17所 示序列的pMD ‑18质粒和含有SEQ  ID NO.18所示序列的pMD ‑18质粒的混合液， 所述阴性对照 为灭菌去离 子水。 6.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 所述核酸释放剂通过以下方法制备得 到： 配制400mM/L的Tris ‑HCl溶液， 加 入乙二胺四乙酸二钠， 使乙二胺四乙酸二钠浓度达到 3mM/L， 加入NaCl， 使NaCl浓度达到130mM/L， 加入质量分数为2.0％的十二烷基硫酸锂和质 量分数为1％的甜菜碱， 加入质量分数2％的十二 烷基磺酸钠， 混匀， 即可。 7.一种采用权利要求2～6任一项所述试剂盒检测动物样品中是否感染鸡肠炎沙门氏 菌和滑液囊支原体的方法， 该方法不以疾病的诊断和治疗为目的， 其特征在于， 包含如下步 骤： 1)采用核酸释放剂从待测材料中释放基因组DNA作为模板， 加入PCR反应液A， PCR反应 液B进行荧 光PCR扩增反应， 得到扩增产物； 2)按照下述任一方法确定待测病原是否为鸡肠炎沙门氏菌或滑液囊支原体， 观察扩增 曲线， 结合熔解曲线峰值Tm值分析： A、 若样品出现典型的S型扩增曲线， 且在Tm＝(83.25 ±0.5)℃出现特异性峰， 则判为鸡 肠炎沙门氏菌核酸阳性； B、 若样品出现典型的S型扩增曲线， 且在Tm＝(88.61 ±0.5)℃出现特异性峰， 则判为滑 液囊支原体核酸阳性； C、 若样品出现典型的S型扩增曲线， 且在Tm＝(83.25 ±0.5)℃和Tm＝(88.61 ±0.5)℃ 均出现峰值， 表明鸡肠炎 沙门氏菌和滑液囊支 原体混合感染。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述PCR反应液A， PCR反应液B和模板的体 积比为13.8： 4.2： 2。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述第一正向引物的终浓度为0.6 μmol/L，权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114574605 A 2第一反向引物的终浓度为0.75 μmol/L， 第二正向引物的终浓度为0.4 μmol/L， 第二反向引物 的终浓度为0.3 5 μmol/L。 10.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述荧光PCR扩增反应的条件为： 预变性 95℃ 2min； 变性94℃  5s， 退火55℃  20s， 此处收集荧光， 共40个循环； 反应结束后进行溶解 曲线分析， 具体程序为： 60℃  1min， 以0.1℃/s的速率升温， 直到97℃， 整个过程连续采集荧 光， 最后40℃冷却， 绘制扩增产物的熔解曲线。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114574605 A 3