(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210350043.7 (22)申请日 2022.04.02 (71)申请人 麦克奥迪 （厦门） 病理研究院有限公 司 地址 361000 福建省厦门市 火炬高新区(翔 安)产业区舫山 南路810之3A (72)发明人 洪炯志　富继义　 (74)专利代理 机构 厦门纳益维知专利代理事务 所(普通合伙) 35273 专利代理师 黄华 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 胎儿染色体非整倍体多重数字PCR检测的引 物、 探针及其试剂盒和应用 (57)摘要 本发明提供了一种胎儿染色体非整倍体多 重数字PCR检测的引物、 探针及其试剂盒和应用， 包括用于检测第21、 18、 13号染色体非整倍体的 引物和探针。 本发明克服了N GS技术平台耗时长、 成本高和技术操作要求高， 以及常规多重数字 PCR需要设计和使用多条检测探针导致的成本 高， 设计难度高等缺点； 本发明可使用但不限于 使用孕周5～8周的宫颈脱落细胞或其他含有胎 儿DNA的样本， 避免有创取样导致的流产 情况， 是 一种操作简单、 成本低、 时效快且准确度高的试 剂盒及检测方法， 可用于多重数字PCR平台检测 胎儿染色体 拷贝数变异现象。 权利要求书2页 说明书19页 序列表20页 附图14页 CN 114807345 A 2022.07.29 CN 114807345 A 1.一种胎儿染色体非整倍体多重数字PCR检测的引物和探针， 其特 征在于， 包括： 用于检测第21号染色体非整倍体的Seq  ID No.1‑40所示核苷酸序列的引物和Seq  ID  No.121所示核苷酸序列的探针； 用于检测第18号染色体非整倍体的Seq  ID No.41‑80所示核苷酸序列的引物和Seq  ID  No.122所示核苷酸序列的探针； 用于检测第13号染色体非整倍体的Seq  ID No.81‑120所示核苷酸序列的引物和Seq   ID No.123所示核苷酸序列的探针。 2.根据权利要求1所述的引物和探针， 所述探针的5 ’端连接荧光报告基团， 3 ’端淬灭基 团连接； 优选的， 所述探针加入了L NA修饰和/或MGB修饰； 优选的， 用于检测21号染色体的探针5 ’端标记为FAM荧光修饰， 3 ’端标记为BHQ1淬灭修 饰； 优选的， 用于检测18号染色体的探针5 ’端标记为HEX荧光修饰， 3 ’端标记为BHQ1淬灭修 饰； 优选的， 用于检测13号染色体的探针5 ’端标记为ROX荧光修饰， 3 ’端标记为BHQ2淬灭修 饰。 3.根据权利要求1或2所述的引物和探针在制备胎儿染色体非整倍体多重数字PCR检测 的试剂盒中的应用。 4.一种胎儿染色体非整倍体多重数字PCR检测的试剂盒， 其特征在于， 包括如权利要求 1或2所述的引物和探针。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括PCR反应液； 所述PCR反应液至少 包括无核酸酶水、 缓冲液Buf fer和Taq酶。 6.一种胎儿染色体非整倍体多重数字PCR检测 的方法， 其特征在于， 至少包括以下步 骤： 1)对待测样品进行处 理， 提取脱落细胞DNA或血浆游离DNA； 2)利用权利要求4或5所述的试剂盒以及所述提取的DNA， 配制多重数字PCR扩增反应 液； 3)将所述反应液置于多重数字PCR设备中， 生成液滴并进行PCR扩增、 拍照以及数据分 析； 4)分别获得FAM、 HEX和ROX荧光通道检测结果， 分别计算提取的DNA中21、 18和13号染色 体的拷贝数比值， 通过统计学 方法判定胎儿是否存在13、 18或21号染色体非整倍体疾病。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 步骤1)所述待测样品为含有胎儿DNA的样 品， 如孕周至少5周的孕妇宫颈脱落细胞或孕周至少10周的孕妇 外周血， 优选为孕周5 ‑8周 的孕妇宫颈脱落细胞。 8.根据权利 要求6所述的方法， 其特征在于， 步骤2)所述多重数字PCR扩增反应液中， 每 对所述引物的终浓度为10 0‑400nM； 所述探针的终浓度为10 0‑400nM； 优选的， 按总体积25uL计算， 所述多重数字PCR扩增反应液配方包括： 缓冲液Buffer   12.5uL、 Taq酶0.6uL、 无核酸酶水5 ‑7uL和提取的DNA  1‑2.5uL。 9.根据权利要求6 ‑8中任一项所述的方法， 其特征在于， 步骤3)所述多重数字PCR程序权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114807345 A 2为： 95℃预变性10分钟； 45个循环94℃变性10秒， 58 ‑60℃退火延伸1分钟； 98℃酶灭活5分 钟； 35℃保温。 10.根据权利要求6 ‑9中任一项所述的方法， 其特 征在于， 步骤4)所述判定的方法为： 阴性样本的判定： 当13、 18或21号染色体各自与其他两个染色体的拷贝数比例均在 0.95‑1.05时， 则检测样本不存在13、 18或21号染色体的拷贝数变异情况； 阳性样本的判定： 当13、 18或21号染色体各自与其他两个染色体的拷贝数比例均在 1.05‑1.5时， 则检测样本存在13、 18或21号染色体的拷贝数变异情况。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114807345 A 3