(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210351969.8 (22)申请日 2022.04.02 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114561380 A (43)申请公布日 2022.05.31 (73)专利权人 予果生物科技 （北京） 有限公司 地址 102600 北京市大兴区北京经济技 术 开发区地盛东路1号院6号楼5 01室 专利权人 西咸新区予果 微码生物科技有限 公司　 予果智造科技 （北京） 有限公司 (72)发明人 夏涵　官远林　付健　尚芳娟　 王鹏军　杨书恒　李长诚　佟斯垚　 (74)专利代理 机构 西安鼎迈知识产权代理事务 所(普通合伙) 6126 3 专利代理师 李振瑞 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (56)对比文件 CN 112980979 A,2021.0 6.18 CN 1070904 48 A,2017.08.25 CN 112980979 A,2021.0 6.18 CN 111154847 A,2020.0 5.15 US 2020149120 A1,2020.0 5.14 CN 107354149 A,2017.1 1.17 CN 101713 002 A,2010.0 5.26 赵雪 等.沙门氏菌耐药基因的核酸恒温扩 增快速检测. 《沈阳农业大 学学报》 .2021, 夏涵.新型压电石英DNA传感器微阵列的构 建及其在血 液感染病原菌快速 检测中的应用. 《中国博士学位 论文全文数据库医药卫 生科技 辑》 .2010,(第6期), 许金朋等.C helex-10 0法直接提取乳样中奶 牛乳房炎主 要致病菌DNA方法的建立. 《中国畜牧 兽医》 .2014,(第1 1期), 审查员 王小玉 (54)发明名称 细菌核酸提取检测试剂、 试剂盒及其方法和 应用 (57)摘要 本发明提供了一种用于细菌核酸提取检测 试剂、 试剂盒及其方法和应用， 所述提取检测试 剂含有InstaGeneMatrix、 SDS、 KCl、 EDTA和 Sarkosyl， 本发明能够实现快速高效提取大肠杆 菌核酸DNA， 将大肠杆菌的提取检测限提高到100 拷贝数/ml； 从复杂样本中亦能快速高效提取到 大肠杆菌核酸， 验证了本提取方法潜在的临床适 用性。 权利要求书1页 说明书8页 附图1页 CN 114561380 B 2022.12.16 CN 114561380 B 1.一种细菌核酸 提取检测方法， 其特 征在于， 所述的提取检测方法包括如下步骤： (1)将含有 核酸样本 离心沉淀， 参数为10 000‑14000rpm， 移除上清； (2)加入由Inst aGene Matrix、 SDS、 KCl、 EDTA和Sarkosyl组成的核酸提取检测试剂到 步骤(1)得到的菌落沉淀物， 震荡混匀； 之后将混合物置于沸水浴中， 放置5 ‑10分钟， 之后室 温冷却1‑3分钟； 所述提取检测试剂中In staGene Matrix的质量浓度为1％ ‑5％， SDS的质量 浓度为1％‑20％， KCl物质的量浓度为10mmol/L ‑100mmol/L； ED TA物质的量浓度为1mmol/L ‑ 10mmol/L， Sarkosyl的质量浓度为1％ ‑5％， 所述提取检测试剂是将上述InstaGene   Matrix、 SDS、 KCl、 EDTA和Sark osyl混合后配置形成对应浓度的混合液； (3)将裂解产物高速 离心沉淀， 参数为10 000‑14000rpm； (4)取上清液， 用于后续的质量控制与目标基因检测； (5)引物设计与合成、 PCR扩增、 PCR检测与结果分析。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114561380 B 2细菌核酸提取检测试剂、 试剂盒及其方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及生物技 术领域， 具体涉及 细菌核酸的提取与检测技 术领域。 背景技术 [0002]核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物， 为生命的最基本物质之一。 核 酸提取是指利用物理、 化学等方法将核酸从样品中分离出来的过程， 分离得到高质量的核 酸是分子生物学研究 的关键步骤。 传统的核酸提取法包括传统的酚—氯仿 法、 盐析法、 滤膜 离心柱法等。 硅胶膜吸附柱法、 抗DNA单克隆抗体的免疫亲和法、 自动化平台广泛应用的磁 珠法核酸提取方法作为当前主流的核酸提取方法都已经有商业化的核酸提取试剂盒提供。 然而， 传统的核酸 提取试剂盒提取的核酸质量较差， 不能满足 实际需求。 [0003]近年来随着分子生物学和生物技术的发展， 基于核酸扩增的检测技术不断涌现， 如实时定量PCR(Real ‑time polymerase  chain reaction,RT ‑PCR)、 环介导等温扩增技术 以及宏基因组测序(metageno mic next‑generation  sequencing， mN GS)， 均具有快速、 灵敏 的特点， 已被广泛使用以确定临床样本中大肠杆菌的存在。 但是检测过程中仍然存在操作 复杂， 引入 试剂多， 而且细菌的相对含量较少， 导致DNA裂解液中有效物质含量低。 比如 采用 特殊硅基质材料在一定的高盐、 低pH值情况下高效、 专一地吸附核酸， 在低盐、 高pH值情况 下释放核酸； 或者基于一种固相载体可逆化固定的分离纯化的磁珠纯化方法都被广泛应用 于核酸提取以及纯化等领域。 但是以上两种核酸提取技术步骤繁杂， 尤其是前处理步骤涉 及到多次液相转移和加溶液过程， 使得整个流程的操作时间较长。 不仅容易造成交叉污染， 而且在成本上都较高， 使得 大规模广泛应用的成本居高不下。 发明内容 [0004]针对上述内容中所记载的技术问题中的一种， 本发明提出了一种细菌核酸提取检 测试剂、 试剂盒及其方法和应用， 改善了当前细菌核酸提取与检测的窘境， 减少了操作步 骤， 大幅降低交叉污染的可能性。 该方法相较于背景技术提到的两种常用方法也降低了使 用成本， 相较于柱法和磁珠法分别降低到原来二百分之一和五十分之一， 而且检测限可低 于100拷贝/ml， 优于目前市场上绝大多数检测平台。 [0005]第一方面， 本发明提供了一种用于细菌核酸提取检测试剂盒， 所述试剂盒包括引 物序列和提取检测试剂， 所述提取检测试剂由质量浓度为1％ ‑5％的InstaGene  Matrix、 质 量浓度为1％ ‑20％的SDS、 物质的量浓度为10mmol/L ‑100mmol/L的KCl、 物质的量浓度为 1mmol/L‑10mmol/L的EDTA、 质量浓度为1％ ‑5％的Sark osyl组成。 [0006]第二方面， 本发明提供了用于细菌核酸提取检测试剂盒在大肠杆菌核酸提取检测 中的应用。 [0007]具体的 ， 本发明所述提取检测采用的引物序列信息为： SEQ ‑ID NO1： TGCGGGCGGCTTT； SEQ‑ID NO2： GGCGGCGCAAAAA。 [0008]第三方面， 本发明还提供了一种细菌核酸的提取限的确定方法， 所述方法包括如说　明　书 1/8 页 3 CN 114561380 B 3