(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210350761.4 (22)申请日 2022.04.02 (66)本国优先权数据 202210321927.X 202 2.03.29 CN (71)申请人 河南省农业科 学院动物免疫学重点 实验室 地址 450002 河南省郑州市金 水区花园路 116号 (72)发明人 郭振华　宋佳　孙亚宁　王建昌　 金前跃　李青梅　杨继飞　 (74)专利代理 机构 郑州市华翔专利代理事务所 (普通合伙) 41122 专利代理师 张爱军 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6844(2018.01) G01N 33/543(2006.01) G01N 33/558(2006.01) (54)发明名称 一种基于RPA等温扩增和免疫层析技术的伪 狂犬病毒检测组合物、 方法及试剂盒 (57)摘要 本发明涉及一种RPA等温扩增和免疫层析技 术相结合的伪狂犬病毒检测组合物、 方法及试剂 盒， 属于疾病检测领域。 本发明针对PRV的gE基 因， 通过筛选获得一组具有很高RPA扩增效率的 引物探针， 进一步结合免疫层析技术建立了胶体 金试纸条RPA 检测方法， 实现了PRV感染的临床快 速检测。 同时样品通过高温处理即可实现核酸模 板的制备， 极大降低整个检测成本， 缩短检测时 间。 该方法具有良好的特异性， 灵敏度可达21个 拷贝/反应或者6 ×100TCID50/反应； 临床样品检 测显示， 本发明和国标GB/T35911 ‑2018推荐的 PRV检测方法结果完全一致， 具有较好的实际应 用价值。 权利要求书2页 说明书6页 序列表3页 附图4页 CN 114703177 A 2022.07.05 CN 114703177 A 1.一种基于RPA等温扩增和免疫层析技术的伪狂犬病 毒检测组合物， 其特征在于， 引物 和探针序列如下： 上游引物gE ‑For： 5'‑CTCCCCCAGCGGAGACAGCG GCTACGAG ‑3'； 下游引物gE ‑Rev： 5'‑biotin‑ACAGGCGGTTGGCGGTCACGCCATAGTT‑3'； 探针gE‑Pro： 5'‑FAM‑CGACGGGCTGTACGTGCGC CCCGAGGAGGCGCCCC(THF)GCTC CGGCTTCGACGTC ‑C3‑3'。 2.如权利 要求1所述的组合物， 其特征在于， 所述下游引物5 ’端用生物素biotin进行修 饰； 探针5 ’端用FAM进行修饰， 离5 ’端第35位碱基C用四氢呋喃THF修饰， 3 ’端有聚合酶延伸 阻断基团C 3‑spacer。 3.如权利要求1所述的组合物在制备检测伪狂犬病毒的试剂或试剂盒中的应用。 4.一种利用权利要求1所述的组合物制备的检测伪狂犬病 毒的试剂 盒， 其特征在于， 所 述试剂盒由试剂A、 试剂B、 试剂C、 试剂D、 试剂E和胶体金试纸条 组成； 其中， 试剂A为 RPA重组 酶聚合酶冻干粉； 试剂B为RPA反应 混合液； 试剂C为阳性对照， 包含 标准质粒p UC57‑gE； 试剂 D为阴性对照， 为无菌无酶水； 试剂E为磷酸盐缓冲液。 5.如权利 要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述RPA反应混合液包括： 5 μM上游引物gE ‑ For 2 μL， 5 μM下游引物gE ‑Rev 2 μL， 5 μM探针gE ‑Pro 0.5 μL， 280mM醋酸镁2.5 μL， RPA重组酶 聚合酶反应缓冲液25 μL， 无菌无酶水13 μL； 所述试剂C标准质粒pUC57 ‑gE的浓度为4.2 ×105 拷贝/ μL； 试剂E磷酸盐缓冲液的pH值 为7.0。 6.一种利用权利要求1所述的组合物检测伪狂犬病 毒的方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： 1)待测样品DNA模板的准备； 2)采用权利要求1所述的组合物建立RPA扩增反应 体系； 3)进行RPA扩增反应； 4)利用胶体金 试纸条进行 结果判定 。 7.如权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述待测样品DNA模板的获取采用商品化试 剂盒进行提取 纯化或高温裂解法； 所述高温裂解法为： 将100μL的待测样品和200μL、 pH  7.0的PBS缓冲液混合， 95 ‑100℃ 加热5min， 然后以5000rpm的速度离心5min， 所得上清即为待测样品的DNA模板， 转移至新的 离心管备用； 所述待测样品为血清、 口腔液或组织匀浆的上清。 8.如权利要求6所述的方法， 其特 征在于， 所述RPA扩增反应 体系包括： 试剂A： RPA重组酶聚合酶冻干粉； 试剂B： RPA反应混合液： 5μM上游引物gE ‑For 2μL， 5μM下游引物gE ‑Rev 2μL， 5μM探针 gE‑Pro 0.5 μL， 280mM醋酸镁2.5 μL， RPA重组酶聚合酶反应缓冲液25 μL， 无菌无酶水13 μL； 试剂E： 磷酸盐缓冲液、 pH  7.0。 9.如权利要求8所述的方法， 其特 征在于， 所述RPA扩增反应为： 将45μL试剂B加入试剂A中， 然后加入5μL待测样品DNA模板； RPA扩增反应温度为39℃， 反应时间20 ‑30min； 反应结束后， 向反应产物中加入150 μL试剂E， 得到混合物； 然后取100 μL 混合物加到胶体金 试纸条上样卡的样品垫上， 反应10mi n后读取结果。 10.如权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述胶体金试纸条的样品垫标记的为金标权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114703177 A 2抗FAM的单克隆抗体， 检测线标记的为抗biotin的单克隆抗体， 质控线标记的为葡萄球菌A 蛋白。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114703177 A 3