(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210336694.0 (22)申请日 2022.04.01 (71)申请人 中国疾病预防控制中心传染病预防 控制所 地址 102206 北京市昌平区昌百路15 5号 (72)发明人 赵硕　阚飙　卢昕　张京云　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 王文君 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/63(2006.01) (54)发明名称 油包菌数字PCR检测霍乱弧菌活的非可培养 细胞的方法 (57)摘要 本发明涉及微生物 技术领域， 尤其涉及油包 菌数字PCR检测霍乱弧菌活的非可培养细胞的方 法。 所述方法包括： 针对经过PMA处理的待检测霍 乱弧菌样本， 采用PBS洗涤1~3次， 采用热裂解释 放DNA后进行PCR检测； 根据检测结果判断VBNC状 态霍乱弧菌的数量； 所述热裂解法包括： 在PCR循 环开始的预变性步骤添加92~98℃， 10~15分钟的 处理步骤， 以及4~37℃， 10~15分钟的冷处理步 骤。 本发明通过油包菌数字PCR对霍乱弧菌的 VBNC状态进行检测和绝对定量， 可以准确、 快速 地检测出VBNC状态霍乱弧菌细胞的数量， 这对于 霍乱弧菌的VNBC细胞的检测有重要意 义。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图2页 CN 114480693 A 2022.05.13 CN 114480693 A 1.油包菌数字PCR检测霍乱弧菌活的非可培 养细胞的方法， 其特 征在于， 包括： 针对经过PMA处理的待检测霍乱弧菌样本， 采用PBS洗涤1~3次， 采用热裂解释放DNA后 进行PCR检测； 根据检测结果判断VBNC状态霍乱弧菌的数量； 所述热裂解法包括： 在PCR循环开始的预变性步骤添加92~98℃， 10~15分钟的处理步 骤， 以及4~37℃， 10~15分钟的冷处 理步骤。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述PCR检测的对象为thyA， 包括如SEQ  ID  NO.1所示的核苷酸序列。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特 征在于， 所述PCR检测中所用引物对为： thyA正向引物： 5' ‑ACATGGGACGCGTGTATG G‑3'， thyA反向引物： 5' ‑  ATATGACCACCATCAGGCTTAGC  ‑3'。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述PCR检测为qPCR或d dPCR检测。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 所述qPCR的反应程序为： 95 °C ， 10min； 95 ℃， 5 s； 54℃， 3 0s循环40次； 和/或， 所述d dPCR的反应程序为： 95°C， 10 min； 95°C， 30 s和54°C， 30 s的40个循环； 4℃， 5mi n， 90℃， 5mi n。 6.根据权利要求1 ‑5任一项所述的方法， 其特 征在于， 所述PMA处 理包括如下流 程： 将所述待检测霍乱弧菌样本置于4℃条件下， 采用20~30mM的PMA处理20~30分钟， 然后 采用卤素灯在冰上照射15~25分钟。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述待检测霍乱弧菌样本为水环境下的待 检测霍乱弧菌样本 。 8.权利要求1 ‑7任一项所述的方法在定量检测水环境中VNBC状态的霍乱弧菌中的应 用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480693 A 2油包菌数字PCR检测霍乱弧菌活的非可培养细胞的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及微生物技术领域， 尤其涉及油包菌数字PCR检测霍乱弧菌活的非可培 养细胞的方法。 背景技术 [0002]活的非可培养状态 （以下简称VBNC） 状态细 菌是一类具有某些生物学活性， 但不能 用常规的培养方法使其生长繁殖和形成菌落的细菌， 其生物学活性可通过测定核酸、 酶、 呼 吸或蛋白质等指标检测出来。 [0003]现有的水体和土壤环境中， 存在大量VBNC状态细菌， 包括有弧菌属、 沙 门氏菌属、 气单胞菌属、 螺杆菌属、 军团菌属、 葡萄球菌属、 弯曲菌属、 志贺氏菌属和 埃希氏菌属等， 其 中包括多种病原菌， 这对公共卫生健康带来巨大威胁。 因此定量检测水环境中VBNC细胞和 死细胞对于水环境微生物研究、 疾病监测和控制是非常重要的。 但是传统用于染色法和显 微镜观察法无法准确定量VBNC细胞。 发明内容 [0004]为了解决现有技术存在的问题， 本发明提供一种油包菌数字PCR检测霍乱弧菌活 的非可培养细胞的方法， 通过PBS洗涤热裂解释放DNA， 有效提高检测VBNC状态霍乱弧菌的 准确率。 [0005]第一方面， 本发明提供一种油包菌数字PCR检测VBNC状态霍乱弧菌的方法， 包括： 针对经过PMA处理的待检测霍乱弧菌样本， 采用PBS洗涤1~3次， 采用热裂解释放 DNA后进行PCR检测； 根据检测结果判断VBNC状态霍乱弧菌的数量； 所述热裂解法包括： 在PCR循环开始的预变性步骤添加92~98℃， 10~15分钟的处理 步骤， 以及4~37℃， 10~15分钟的冷处 理步骤。 [0006]进一步地， 所述PCR检测的对象为thyA， 包括如SEQ  ID NO.1所示的核苷酸序列。 [0007]进一步地， 所述PCR检测中所用引物对为： thyA正向引物： 5' ‑ACATGGGACGCGTGTATG G‑3'， thyA反向引物： 5' ‑  ATATGACCACCATCAGGCTTAGC  ‑3'。 [0008]进一步地， 所述PCR检测为qPCR或d dPCR检测。 [0009]进一步地， 所述qPCR 的反应程序为： 95 °C ， 10min； 95℃， 5  s； 54℃， 30s循环40次； 所述ddPCR的反应程序为： 95°C， 10 min； 95°C， 30 s和54°C， 30 s的40个循环； 4℃， 5mi n， 90℃， 5mi n。 [0010]进一步地， 所述qPCR的热裂解 步骤为： 在PCR循环开始的预变性步骤添加92~98℃ 10~15分钟的处理步骤， 以及37℃  10~ 15分钟的冷处 理步骤； 和/或， 所述ddPCR的热裂解 步骤为： 在PCR循环开始的预变性步骤添加92~98℃ 10~15分钟的处理步骤， 以及4℃  10~说　明　书 1/7 页 3 CN 114480693 A 3