(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210339236.2 (22)申请日 2022.04.01 (71)申请人 广西医科 大学附属肿瘤医院 地址 530000 广西壮 族自治区南宁市河堤 路71号 (72)发明人 严林海　唐卫中　钟华戈　莫显伟　 (74)专利代理 机构 南宁东之智专利代理有限公 司 45128 专利代理师 严涓逢 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 用于检测人粪便样本中结直肠癌基因甲基 化水平的引物和探 针 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测人粪便样本中 结直肠癌基因甲基化水平的引物和探针， 包括用 于检测SDC2甲基化水平的引物和探针和/或用于 检测Septin9甲基化水平的引物和探针和/或用 于检测MLH1甲基化水平的引物和探针。 本发明提 供的引物和探针可用于结直肠肿瘤的早期诊断， 为结直肠肿瘤早发现提供了一个简便易行的解 决方案。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图3页 CN 114507739 A 2022.05.17 CN 114507739 A 1.用于检测人粪便样本中结直肠癌基因甲基化水平的引物和探针， 其特征在于： 包括 用于检测SDC2甲基化水平的引物和探针和/或用于检测Septin9甲基化水平的引物和探针 和/或用于检测MLH1甲基化水平的引物和探针； 所述用于检测SDC2甲基化水平的引物为： 上游引物选自SEQ  ID No:1所示的序列， 下游 引物选自SEQ  ID No:2所示的序列， 探针为选自SEQ  ID No:3所示的序列； 所述用于检测Septin9甲基化水平的引物为： 上游引物选自SEQ  ID No:4所示 的序列， 下游引物选自SEQ  ID No:5所示的序列， 探针为选自SEQ  ID No:6所示的序列； 所述用于检测MLH1甲基化水平的引物为： 上游引物选自SEQ  ID No:7所示的序列， 下游 引物选自SEQ  ID No:8所示的序列， 探针为选自SEQ  ID No:9所示的序列。 2.根据权利要求1所述的引物和探针， 其特 征在于： SEQ ID No:3、 SEQ  ID No:6、 SEQ  ID No:9所示的序列5'端标记有HEX荧光基团， 各所述 探针3'端标记有MGB淬灭基团。 3.人粪便样本中结直肠癌基因甲基化水平的检测方法， 其特 征在于包括以下步骤： （1） 样品的制备： 从收集到的人粪便样本中进行  DNA 的提取及亚硫酸盐的处 理； （2） PCR 扩增： 加入权利 要求1所述的引物和探针， 将步骤 （1） 中提取及亚硫酸盐处理后 的 DNA 进行荧光定量 PCR 检测； （3） 甲基化水平分析： 计算目标基因  SDC2、 Septin9、 MLH1  与内参基因  ACTB 的扩增  Ct 比差值， 得到样本相对甲基化水平。 4.根据权利要求3所述的检测方法， 其特 征在于： 所述步骤 （2） 中， ACTB  扩增所用引物为： 上游引物为SEQ  ID No:10所示的序列， 下游引物为SEQ  ID No:11所示的序列； ACTB 扩增所用探针为SEQ  ID No:12所示的序列， 探针5'端标记有HEX荧光基 团， 3'端 标记有BHQ2淬灭基团； 亚硫酸盐处 理后的ACTB  扩增所用引物为： 上游引物为SEQ  ID No:13所示的序列， 下游引物为SEQ  ID No:14所示的序列； ACTB 扩增所用探针为SEQ  ID No:15所示的序列， 探针5'端标记有HEX荧光基 团， 3'端 标记有BHQ2淬灭基团。 5.根据权利要求3所述的检测方法， 其特 征在于： 所述PCR的反应 体系如下： 2×AceQ qPCR Probe Master Mix           10 μL Primer Mix                              4.6 μL 50×  ROX Reference  Dye 2                0.4 μL Template DNA                            5 μL。 6.根据权利要求3或5所述的检测方法， 其特 征在于： PCR反应条件： 95℃预变性2mi n， 95℃10s， 6 0℃30s， 扩增 50个循环， 最后  12℃终延伸。 7.权利要求1或2所述的引物和探针在制备 结直肠癌早期诊断试剂中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114507739 A 2用于检测人粪便样本中 结直肠癌基因甲 基化水平的引物和 探针 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学技术领域， 尤其是一种用于检测人粪便样本中结直肠癌基 因甲基化水平的引物和探针及试剂盒。 背景技术 [0002]结直肠癌 （肠癌） 是世界上第三大恶性肿瘤。 肠癌早期治疗效果好， 中晚期预后极 差， 给家庭和社会带来极大的负担， 严重影响大健康产业的发展， 早诊 是改善预后的最重要 手段， 而积极开展肠癌筛查及早期防治工作， 对于减少政 府相关医疗成本同样重要。 [0003]目前筛查主要有以下几类： （1） 常规血检类， 特异性敏感性不强， 对身体有创伤性； （2） 影像学类， 如肠镜检查、 软式乙状结肠镜、 CT  结肠成像 （虚拟肠镜检查） 、 双对比钡灌肠 （DCBE） 等， 此类方法需要检查前药物清肠、 麻醉等处理， 对身体创伤 性比较严重； （3） 粪便潜 血检测类， 如粪便隐血试验 （FOB T） 、 粪便免疫化学试验 （FIT） 等， 方便无创， 但特异性敏感性 不强。 且以上 方法均需要到医院实施， 处 理周期长， 或者费用较高。 [0004]肠癌作为肠道上皮的异质性疾病， 其特征在于宿主基因突变累积， 因此， 对瘤细胞 异常 DNA 片段的检测， 可以用于结直肠癌的筛查和早期诊断， 该方法不会对身体造成创 伤， 且可以用于全成人年龄段人群的筛查， 但筛选出特异 性、 敏感性 强的试剂盒对该检测方 法的事实至关重要。 发明内容 [0005]本发明公开了一种用于检测人粪便样本中结直肠癌基因甲基化水平的引物和探 针， 提供的引物和探针可用于结直肠肿瘤的早期诊断， 为结直肠肿瘤早发现提供了一个简 便易行的解决方案 。 [0006]为实现上述目的， 本发明的技 术方案为： 一种用于检测人粪便样本中结直肠癌基因甲基化水平的引物和探针， 包括用于检 测SDC2甲基化水平的引物和探针和/或用于检测Septin9甲基化水平的引物和探针和/或用 于检测MLH1甲基化水平的引物和探针； 所述用于检测SDC2甲基化水平的引物为： 上游引物选自SEQ  ID No:1所示的序列， 下游引物选自SEQ  ID No:2所示的序列， 探针为选自SEQ  ID No:3所示的序列； 所述用于检测Septin9甲基化水平的引物为： 上游引物选自SEQ  ID No:4所示的序 列， 下游引物选自SEQ  ID No:5所示的序列， 探针为选自SEQ  ID No:6所示的序列； 所述用于检测MLH1甲基化水平的引物为： 上游引物选自SEQ  ID No:7所示的序列， 下游引物选自SEQ  ID No:8所示的序列， 探针为选自SEQ  ID No:9所示的序列； 进一步的， SEQ  ID No:3、 SEQ ID No:6、 SEQ  ID No:9所示的序列5'端 标记有HEX荧 光基团， 各 所述探针3'端标记有MGB淬灭基团。 [0007]人粪便样本中结直肠癌基因甲基化水平的检测方法， 包括以下步骤：说　明　书 1/8 页 3 CN 114507739 A 3