(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210348373.2 (22)申请日 2022.04.01 (71)申请人 上海信诺佰世医学检验 有限公司 地址 200000 上海市浦东 新区仁庆路3 56号 601、 602、 603、 605、 606、 607、 608室 (72)发明人 彭玲　刘辉超　芮立　黄士栩　 (74)专利代理 机构 武汉天领众智专利代理事务 所(普通合伙) 42300 专利代理师 林琳 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) (54)发明名称 一种检测ALK融合基因的引物和探针组合 物、 试剂盒及方法 (57)摘要 本发明公开了一种检测ALK融合基因的引物 和探针组合物、 试剂盒及方法。 该非诊断目的检 测ALK融合基因的方法包 括如下步骤： S1、 从样品 中提取RNA， 并进行逆 转录， 获得cDNA； S2、 以所述 cDNA为模板， 将 待测样品cDNA模板、 权利要 求1或 2所述的用于检测ALK融合基因的引物和探针组 合物以及ddPCR  Supermix混合， 制备ddPCR混合 液； S3、 用所述ddPCR混合液制作 PCR微反应液滴， 再进行PCR扩增反应； S4、 通过数字PCR仪对PCR扩 增反应后的产物进行荧光信号的采集， 根据荧光 信号的类型， 从而判断出ALK融合基因类型。 本发 明提出了检测ALK融合基因NPM1 ‑ALK、 TPM3 ‑ALK、 TRAF1‑ALK高特异性引物和探针序列， 同时实现 三种融合基因在同一个 反应孔进行检测， 实现对 ALK相关融合基因的筛查及定量检测。 权利要求书2页 说明书8页 序列表3页 附图5页 CN 114807124 A 2022.07.29 CN 114807124 A 1.一种检测ALK融合基因的引物和探针组合物， 其特征在于， 包括用于检测NPM1 ‑ALK融 合基因的引物对和探针、 用于检测TPM3 ‑ALK融合基因的引物对和探针、 用于检测TRAF1 ‑ALK 融合基因的引物对和 探针和ABL内参基因引物对和探针； 所述用于检测NPM1 ‑ALK融合基因 的引物对序列如SEQ  ID NO:1‑2所示， 所述用于检测TPM3 ‑ALK融合基因的引物对序列如SEQ   ID NO:4‑5所示， 所述用于检测TRAF 1‑ALK融合基因的引物对序列如SEQ  ID NO:7‑8所示， 所 述用于检测NPM1 ‑ALK融合基因的探针序列、 所述用于检测 TPM3‑ALK融合基因的探针序列、 所述用于检测TRAF1 ‑ALK融合基因的探针序列分别如SEQ  ID NO:3、 SEQ  ID NO:6、 SEQ  ID  NO:9所示或如SEQ  ID NO:13所示； 所述ABL内参基因引物对序列如SEQ  ID NO:10‑11所示， 探针序列如SEQ  ID NO:12所示。 2.根据权利要求1所述的检测ALK融合基因的引物和探针组合物， 其特征在于， 所述用 于检测NPM1 ‑ALK融合基因的探针序列、 所述用于检测TPM3 ‑ALK融合基因的探针序列和所述 用于检测TRAF1 ‑ALK融合基因的探针序列5'端 标记有FAM报告基团， 3'端 标记MGB荧光基团； 所述ABL内参基因探针序列5'端标记有H EX报告基团， 3'端标记有BHQ1荧 光淬灭基团。 3.一种检测ALK融合基因 的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括权利要求1或2所述的 检测ALK融合基因的引物和探针组合物。 4.根据权利要求3所述的检测ALK融合基因的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括 阳性标准品、 阴性标准品、 d dPCR Supermix和d dH2O。 5.一种非诊断目的检测ALK融合基因的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： S1、 从样品中提取RNA， 并进行逆转录， 获得cDNA； S2、 以所述cDNA为模板， 将待测样品cDNA模板、 权利要求1或2所述的用于检测ALK融合 基因的引物和探针组合物以及d dPCR Supermix混合， 制备d dPCR混合液； S3、 用所述d dPCR混合液制作PCR微反应液滴， 再进行PCR扩增反应； S4、 通过数字PCR仪对PCR扩增反应后的产物进行荧光信号的采集， 根据荧光信号的类 型， 从而判断出ALK融合基因类型。 6.根据权利 要求5所述的非诊断目的检测ALK融合基因的方法， 其特征在于， 步骤S1中， 所述逆转录反应程序如下： 3 0℃、 10mi n， 42℃、 5 0min， 95℃、 5mi n， 4℃、 保温。 7.根据权利 要求5所述的非诊断目的检测ALK融合基因的方法， 其特征在于， 步骤S2中， 所述用于检测ALK融合基因的引物和探针组合物的浓度为10 ×， 其中， 所述用于检测NPM1 ‑ ALK融合基因的引物对序列、 所述用于检测TP M3‑ALK融合基因的引物对序列、 所述用于检测 TRAF1‑ALK融合基因的引物对序列和所述ABL内参基因引物对序列的浓度均为6～9 μM； 所述 用于检测NPM1 ‑ALK融合基因的探针序列、 所述用于检测 TPM3‑ALK融合基因的探针序列、 所 述用于检测TRAF1 ‑ALK融合基因的探针序列和所述ABL内参基因探针序列的浓度均为3～8 μ M。 8.根据权利 要求5所述的非诊断目的检测ALK融合基因的方法， 其特征在于， 步骤S3中， 用所述ddPCR混合液制作PCR微反应液滴的具体方法如下： 将ddPCR混合液加入到微滴发生 器中， 生成15 000～20000个微反应液滴。 9.根据权利 要求5所述的非诊断目的检测ALK融合基因的方法， 其特征在于， 步骤S3中， 所述PCR扩增反应程序如下： 93～97℃预变性3～10min， 93～95℃变性2 0～40s， 55～60℃退 火50～70s， 共进行3 5～45个循环， 10～12℃保温。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114807124 A 210.根据权利要求9所述的非诊断目的检测ALK融合基因的方法， 其特征在于， 所述PCR 扩增反应程序如下： 95℃预变性5min， 94℃变性30s， 60℃退火60s， 共进行40个循环， 12℃保 温。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114807124 A 3