(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210344648.5 (22)申请日 2022.03.31 (71)申请人 河南冠宇仪 器有限公司 地址 450000 河南省郑州市新郑市薛店镇 中德产业园39- 3栋 申请人 河南中检食安 生物科技有限公司 (72)发明人 许世伟　许远　邵俊影　吴镇宇　 王欣　林圣博　 (74)专利代理 机构 成都顶峰专利事务所(普通 合伙) 51224 专利代理师 钱学宇 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 唐菖蒲伯 克霍尔德氏菌的LAMP双链检测探 针、 冻干微球及其制备方法和检测方法 (57)摘要 本发明提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的 LAMP双链检测探针、 冻干微球及其制备方法和检 测方法， 属于基因检测领域。 该双链检测探针包 括发光探针和淬灭探针； 发光探针位于 FIP上， 在 FIP序列的5 ’端标记有荧光发光基团， 淬灭探针 与F1C的序列互补， 淬灭探针的3 ’端标记有荧光 淬灭基团。 LAMP检测冻干微球包括这种双链 检测 探针， 该冻干微球及检测方法， 以唐菖蒲伯克霍 尔德氏菌16 ‑23sRNA为检测靶标， 采用双 链探针‑ 恒温变色体系， 可兼具荧光定量PCR图谱分析及 肉眼观察法来判读结果， 探针特异性强， 变色颜 色对比明显， 不易产生误判， 双重体系互相映照， 检测的准确性高。 权利要求书2页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 114703304 A 2022.07.05 CN 114703304 A 1.一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测探针， 其特征在于， 所述双链检测探针 包括发光探针和淬灭探针； 发光探针位于内引物FIP上， 在所述内引物FIP序列的5 ’端标记有荧光发光基团， 所述 内引物FIP的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 淬灭探针与所述内引物FIP的5 ’端前20个序列互补， 所述淬灭探针的3 ’端标记有荧光 淬灭基团， 淬灭探针的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示。 2.根据权利要求1所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测探针， 其特征在于， 所 述荧光发光基团包括FAM、 VIC、 TET； 所述荧光淬灭基团包括TAMRA、 QSY、 BHQ。 3.一种用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球， 其特征在于， 所述冻干微球 中含有如权利要求1或2所述的LAMP双链检测探针。 4.根据权利要求3所述的用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球， 其特征在 于， 所述冻干微球还包括检测引物组， 所述检测引物组针对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌16S～ 23S rRNA基因区间保守序列设计， 所述检测引物组包括外引物F3、 外引物B3、 内引物FIP、 内 引物BIP； 所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示； 所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示。 5.根据权利要求4所述的用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球， 其特征在 于， 所述双链检测探针中所述发光探针和淬灭探针的浓度比为1:1.2 ～1.8。 6.根据权利要求4所述的用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球， 其特征在 于， 所述外引物F3和外引物B3的浓度均为0.15～0.25 μM， 所述内引物FIP和所述内引物BIP 的浓度均为1.5～1.7 μM 。 7.一种用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测的冻干微球的制备方法， 其特征在于， 其 包括： 将如权利要求1或2所述的LAMP双链检测探针、 检测引 物组与LAMP反应基液混合， 得到 扩增反应 体系； 将所述扩增反应体系与冻干保护剂混合， 逐滴滴入液氮中， 控制每个液滴的体积为23 ～26 μL， 速冻成球后， 冷冻干燥； 其中， 所述检测引物组包括外引物F3、 外引物B3、 内引物FIP、 内引物BIP； 所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示； 所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示。 8.根据权利要求7所述的用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测 的冻干微球的制备方 法， 其特征在 于， 所述LAMP反应基液包括： BST聚合酶、 dNTPs、 MgSO4、 显色剂、 甜菜碱、 pH调节 剂、 ddH2O和buffer。 9.根据权利要求7所述的用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌LAMP检测 的冻干微球的制备方权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114703304 A 2法， 其特征在于， 所述扩增反应 体系与所述冻干保护剂的体积比为14～16: 8； 所述冻干保护剂包括海藻糖、 PEG20 000和甘氨酸中的至少一种。 10.一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP双链检测方法， 其特 征在于， 其包括： 将如权利要求3～6任一项所述的冻干微球加水复溶后， 形成LAMP反应 体系； 将来自待测样品中的模板DNA与所述LAMP反应体系混合， 于60～65℃下反应50～ 70min， 进行LAMP扩增。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114703304 A 3