(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210330443.1 (22)申请日 2022.03.31 (71)申请人 宁波大学 地址 315211 浙江省宁波市江北区风 华路 818号 (72)发明人 曹宇浩　宋雪梅　竺亚斌　赵枫　 庞倩　 (74)专利代理 机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 4 4245 专利代理师 高宁馨 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/113(2010.01)C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 与皮肤修复相关的miRNA标志 物及其应用 (57)摘要 本发明属于生物 技术领域， 具体公开了一种 与皮肤修复相关的miRNA标志物及其应用， 本发 明开发了基于实时定量PCR技术的组织miRNA的 两步法检测试剂、 试剂盒和检测方法。 本发明所 述miRNA包括miR‑7a‑5p、 miR‑335‑5p和miR‑501‑ 3p中的一种或多种。 所述试剂盒含有检测上述 miRNA的探针组合， 本发明所述 miRNA可作为标志 物用于皮肤修复过程研究、 皮肤修改相关药物筛 选， 也可以作为标志物用于检测皮肤炎症和细胞 凋亡。 本发 明提供的检测试剂盒和检测方法具有 使用样本量小， 自动化程度高， 特异性好的优点， 结合其他检测指标和临床症状， 可显著提高检测 效率， 便于皮肤外伤修复药物的批量筛选及临床 检测使用。 权利要求书1页 说明书11页 附图6页 CN 114875128 A 2022.08.09 CN 114875128 A 1.miRNA分子作为标志物在皮肤修复过程检测中的应用， 其特征在于： 所述miRNA分子 为miR‑7a‑5p、 miR‑335‑5p和miR‑501‑3p中的一种或多种。 2.miRNA分子作为靶标在皮肤修复相关药物筛选中的应用， 其特征在于： 所述miRNA分 子为miR‑7a‑5p、 miR‑335‑5p和miR‑501‑3p中的一种或多种。 3.miRNA分子作为皮肤炎症和细胞凋亡标志物的应用， 其特征在于： 所述miRNA分子为 miR‑7a‑5p、 miR‑335‑5p和miR‑501‑3p中的一种或多种。 4.miRNA分子在制备皮肤修复过程检测试剂、 皮肤炎症和细胞凋亡诊断试剂中的应用， 其特征在于： 所述miRNA分子为miR ‑7a‑5p、 miR‑335‑5p和miR‑501‑3p中的一种或多种。 5.miRNA分子在制备皮肤修复过程检测用试剂盒、 皮肤炎症和细胞凋亡诊断试剂盒中 的应用， 其特征在于： 所述 miRNA分子为 miR‑7a‑5p、 miR‑335‑5p和miR‑501‑3p中的一种或多 种。 6.根据权利要4或权利要求5所述的应用， 所述试剂/试剂盒为基于PCR平台miRNA两步 法检测试剂/试剂盒。 7.根据权利 要4或权利要求5所述的应用， 所述试剂/试剂盒包括miRNA分子特异性茎环 结构转录引物、 看家基因U6转录引物、 探针序列、 PCR正向引物引物、 PCR反向引物、 PCR通用 下游引物； 其中， miR‑7a‑5p对应的转录引物如SEQ  ID NO.5所示， miR ‑7a‑5pPCR正向引物序列如SEQ  ID  NO.6所示， miR ‑7a‑5p探针序列如SEQ  ID NO.7所示； miR‑335‑5p对应的转录引物为如SEQ  ID NO.8所示， miR ‑335‑5p PCR正向引物序列如 SEQ ID NO.9所示， miR ‑335‑5p探针序列如SEQ  ID NO.10所示； miR‑501‑3p对应的转录引物如SEQ  ID NO.11所示， miR ‑501‑3pPCR正向引物序列为如 SEQ ID NO.12所示， miR ‑501‑3p探针序列为如SEQ  ID NO.13所示， miRNA分子miR ‑7a‑5p、 miR‑335‑5p和miR‑501‑3p的PCR反向引物序列为miRNA  PCR通用 下游引物， 所述miRNA  PCR通用下游引物序列如SEQ  ID NO.14所示； 看家基因U6对应的转录引物如SEQ  ID NO.15所示， 看家基因U6  PCR正向引物序列如如 SEQ ID NO.16所示， 看家基因U6探针序列如SEQ  ID NO.17所示， 看家基因U6  PCR反向引物 序列如SEQ  ID NO.18所示。 8.一种基于miRNA双通道检测体系， 其特征在于： 所述体系包含miRNA分子标志物miR ‑ 7a‑5p、 miR‑335‑5p、 miR‑501‑3p； 标记物标记的分子杂交探针； miRNA分子标志物特异性茎 环结构转录引物、 PCR正向引物引物、 PCR通用下游引物。 9.根据权利要求1 ‑7任一所述的应用， 或权利要求8所述的体系， 其特 征在于： 所述miR‑7a‑5p的序列为UG GAAGACUAGUGAU UUUGUUGU （SEQ ID NO.1） ； 所述miR‑335‑5p的序列为UCA AGAGCAAUAACGAAAAAUGU （SEQ ID NO.2） ； 所述miR‑501‑3p的序列为A AUGCACCCGGGCAAGGAUUUG （SEQ ID NO.3） 。 10.根据权利8所述的体系， 其特征在于， 所述标记物为荧光标记， 优选所述标记为FAM、 HEX标记。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114875128 A 2与皮肤修复相关的miRNA标志物及其应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体而言本发明提供了与皮肤修复相关的miRNA标志 物、 及其在皮肤 修复过程检测、 相关药物筛 选中应用， 以及相关的miRNA检测试剂、 试剂盒。 背景技术 [0002]皮肤由表皮、 真皮、 皮下组织和皮下附属器4个部分组成， 是保护人体不受外来有 害因素损害的天然屏障， 也是人体的第一道防线。 皮肤的重量达人全身体重的5％～15％， 而皮肤的全部面积可达1.5～2平方米。 日常生活中， 皮肤外伤、 皮肤疾病、 大面积烧伤、 慢 性 溃疡或者手术创伤的皮肤缺损经常会导致化脓、 疼痛、 肿痛 等状况， 影响病患的工作及生活 质量， 严重时还 会引发败血症、 破伤风 等疾病， 对患者的生命健康造成威胁。 [0003]皮肤受损后， 正常的创面修复过程通常会经历以血小板聚集活化的凝血阶段、 以 炎性细胞浸润吞噬细胞碎片和细菌为主的炎症阶段， 还有以再上皮化、 肉芽组织形成为主 的增殖阶段和细胞外基质重塑阶段。 皮肤创伤的修复是一个连续且相互重叠的过程， 创面 修复时， 成纤维细胞、 内皮细胞和免疫细胞等不同细胞分泌多类型的细胞 因子， 有序实现细 胞的增殖、 迁移和凋亡等程序， 同时维持细胞外基质的沉积与降解之 间的动态平衡， 最 终实 现创面的愈合。 [0004]MicroRNA （miRNA） 是一类高度保守的非编码单链RNA分子， 长度约22个核苷酸， 由 较长的双链前体miRNA （pre ‑miRNA） 经核糖核酸酶III  Dicer处理而成。 miRNA可通过靶向结 合信使RNA （mRNA） 并使其降解或抑制其翻译， 实现转录后基因表达调控。 miRNA作为基因表 达的重要调控分子， 几乎参与了机体所有的生理和病理过程， 如炎症、 脂代谢、 自噬等。 近年 多项研究结果显示， miRNA  参与调控皮肤及其附属 器的形成和稳态， 且与皮肤再生修复密 切相关。 皮肤创 面愈合的不同阶段中miRNA的表达各不相同， miRNA的异常表达可能会导致 创面的畸形愈合。 [0005]由于miRNA  在维持皮肤正常结构功能及创面再生修复过程中的重要作用， 寻找在 创面再生修复不同阶段与正常皮肤之间存在差异表达的mi RNA， 并建立相应的检测体系， 不 仅可以明确这些特异性的miRNAs在皮肤创面愈合中的作用， 还能为其调控机制的研究提供 基础， 同时为皮肤创面愈合药物的筛 选和评价 提供靶点。 发明内容 [0006]本发明旨在提供一种皮肤修复相关的miRNA组合及其应用， 以及相关的检测试剂、 试剂盒。 从而为解决本领域中皮肤修复、 皮肤创面愈合中过程的监控、 相关药物研发、 皮肤 炎症和细胞凋亡诊断相关问题提供解决方案 。 [0007]为实现上述申请目的， 本发明结合结合miRNA的特点， 检测皮肤受损后， 正常的创 面修复过程的凝血阶段、 炎症阶段、 增殖阶段和重塑阶段中miRNA的表达情况进行检测， 筛 选出了与皮肤外伤修复相关的miRNA分子标志 物。 [0008]在一个方案中， 本发明提供的miRNA分子可以作为标志物用于皮肤修复过程检测，说　明　书 1/11 页 3 CN 114875128 A 3