(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210329547.0 (22)申请日 2022.03.31 (71)申请人 中国人民警察大 学 地址 065000 河北省廊坊市安次区西昌路 220号 (72)发明人 王慧飞　张立安　王志刚　孙科　 侯亚欣　 (74)专利代理 机构 北京中仟知识产权代理事务 所(普通合伙) 11825 专利代理师 田江飞 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/10(2006.01)C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方法及 试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种布鲁氏菌实时荧光定量 PCR检测方法及试剂盒， 由布鲁氏菌属特异性引 物1、 布鲁氏菌属特异性引物2、 布鲁氏菌特异性 探针、 RealTi mePCRMix、 模板DNA、 阳性对照品、 超 纯水。 本发明采用实时荧光定量PCR技术， 能够针 对土壤、 水源、 血液、 粪便、 尿液等环境样本进行 采集检测， 且能够定量检测出布鲁氏菌的拷贝 数， 具有较高的准确性和特异性； 利用该试剂盒 配合国家综合性消防救援队的NBC侦检车， 可以 有效的在生物恐怖袭 击现场发挥作用。 权利要求书3页 说明书17页 附图11页 CN 115029455 A 2022.09.09 CN 115029455 A 1.一种布鲁氏菌实时荧 光定量PCR检测试剂盒， 其特 征在于， 由以下组分组成： 组成成分 布鲁氏菌属特异性引物1 布鲁氏菌属特异性引物 2 布鲁氏菌特异性探针 RealTimePCRMix 模板DNA 阳性对照品 超纯水 其中布鲁氏菌属特异性引物1、 布鲁氏菌属特异性引物2及布鲁氏菌特异性探针的序列 为： 2.根据权利要求1所述的布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征在于， 所述阳 性对照品为布鲁氏菌活疫苗中提取的布鲁氏菌质粒。 3.根据权利要求1所述的布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征在于， 所述模 板DNA为布鲁氏菌活疫苗中提取的布鲁氏菌质粒。 4.根据权利要求2或3所述的布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征在于， 提取 布鲁氏菌质粒 具体方法为： 使用艾德莱公司生产的高纯质粒小量快速提取 试剂盒提取布鲁氏菌质粒： (1)使用前将试剂盒中 的RNaseA加入P1溶液中， 使P1的浓度为100ug/ml， 并在去蛋白液 PE和漂洗液WB瓶中加入指定量的无 水乙醇； (2)柱平衡步骤： 将新的硅胶膜吸附柱放到收集管中， 用移液枪吸取100μL的平衡液到 吸附柱中， 13 000rpm离心1mi n， 离心后 倒掉废液， 将吸附柱放回收集管中； (3)用药勺取微量布鲁氏菌灭火疫苗干粉至2ml离心管中， 用移液枪吸取250μL溶液P1 加入离心管， 涡旋振荡直至 菌体悬浮； (4)用移液枪吸取250 μL溶液P2加入离心管中， 温和地上下翻转6 ‑8次使菌体充分裂解， 室温放置4分钟； (5)用移液枪吸取350 μL溶液P3加入离心管中， 立即温和地上下翻转6 ‑8次， 充分混匀出 现白色絮状沉淀； 13 000rpm离心10mi n， 此时在离心管底部形成沉淀， 收集上清液； (6)将步骤(5 )收集的上清液加入经过预平衡处理的吸附柱AC中， 12000rpm离心30 ‑ 60s， 倒掉废液； (7)用移液枪吸取5 00 μL去蛋白液PE 至吸附柱中， 120 00rpm离心3 0s， 倒掉废液；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115029455 A 2(8)用移液枪吸取6 00 μL漂洗液WB至吸附柱中， 120 00rpm离心3 0s， 倒掉废液； (9)重复步骤(8)； (10)倒掉废液后， 将吸附柱放回空收集管中， 120 00rpm离心 2min， 去除漂洗液； (11)将吸附柱AC放置到一个新的离心管中， 用移液枪吸取50μL洗脱缓冲液EB， 提前将 洗脱液放到水浴锅中加热至65 ‑70℃， 室温放置2min， 12000rpm离心1min， 获得布鲁氏菌质 粒。 5.一种布鲁氏菌实时荧 光定量PCR检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)确定阳性对照品、 布鲁氏菌待测样本、 阴性对照样本； (2)使用艾德莱公司生产的高纯质粒小量快速提取试剂 盒提取布鲁氏菌灭火疫苗中的 布鲁氏菌质粒， 并测定布鲁氏菌质粒的浓度， 然后建立布鲁氏菌质粒的标准曲线； (3)使用移液器吸取布鲁氏菌属特异性引物1、 布鲁氏菌属特异性引物2及布鲁氏菌特 异性探针各0.50 μL， 0.5 μL模板DNA， 10.0 μLRealTime  PCR Mix， 8 μLddH2O至2mL的离心管中 形成PCR反应 体系； (4)将配制好的PCR反应 体系使用离心管3 000rpm下震荡3 0s混匀； (5)取出荧光定量PCR专用8联 管； (6)使用移液器在8联 管每个管中滴加19.5 μL的PCR反应 体系； (7)将处理好的布鲁氏菌待测样本在每 个管滴加0.5 μL； (8)对荧光定量PCR专用8联 管加盖， 并用刮板刮平； (9)将荧光定量PCR专用8联 管放入离心机中， 3 000rpm离心15s； (10)将离心好的荧光定量PCR专用8联管装入PCR仪器中， 设定程序进行检测， 循环参数 设置为： 样品体积为20 μL， 热盖温度选择105℃， 运行模式选择模拟管， 95℃5min， 循环1次； 95℃15s， 60℃60s， 此步骤后采集荧光信号， 循环 40次； 按照步骤进行实施荧光定量PCR检测 之后， 得到扩增曲线和Ct值； (11)根据Ct值进行检测结果判断： ； (12)将Ct值代入公式y＝ ‑0.3031x+11.037， 得到待检测样本的拷贝数。 6.根据权利要求5所述的布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方法， 其特征在于， 所述步骤 (2)中建立布鲁氏菌质粒的标准曲线具体包括： (201)拷贝数计算： 利用超微量分光光度计检测质粒浓度， 按照以下公式计算质粒的拷 贝数： 拷贝数(copies/ μL)＝6.02 ×1023(copies/mol) ×质粒浓度(ng/ μL) ×10－9/[(载体分 子量+插入片段分子量) ×660](g/mol)， 则得出质粒拷贝数； (202)标准质粒稀释： 将布鲁氏菌质粒用双蒸水按照10倍的梯度进行稀释， 分别 稀释为 100， 10‑1， 10‑2， 10‑3， 10‑4， 10‑5ng/ μL， 然后进行RT ‑qPCR检测； (203)反应体系为20 μL： 布鲁氏菌属特异性引物 1、 布鲁氏菌属特异性引物2及布鲁氏菌权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115029455 A 3