(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210343426.1 (22)申请日 2022.03.31 (71)申请人 杭州丹威 生物科技有限公司 地址 311100 浙江省杭州市余杭区仓前街 道余杭塘路2959号4幢2层、 6层601、 9 层902、 1幢2层 (72)发明人 刘松林　赵丹蕊　郭兴中　陈文　 秦泽倩　倪佳润　 (74)专利代理 机构 杭州君锐知产专利代理事务 所(普通合伙) 33443 专利代理师 方琦 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12Q 1/6804(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种丙肝病毒的富集实时荧光RT-PCR检测 方法 (57)摘要 本发明涉及一种丙肝病毒的富集实时荧光 RT‑PCR检测方法,该方法包 括以下步骤： S1、 免疫 磁珠的制备： 将丙肝病毒抗体偶联至羧基修饰的 超顺纳米磁珠上， 得到偶联丙肝病毒抗体的免疫 磁珠； S2、 丙肝病毒阳性样本的富集： 将丙 肝病毒 阳性血清或血浆与偶联丙肝病毒抗体的免疫磁 珠混合， 孵育； S3、 富集后的丙肝病毒的分离： 用 磁性工具分离免疫磁珠 ‑病毒复合物， 将其重悬 于TE缓冲液中加热裂解， 得到丙肝病毒的裂解产 物； S4、 实时荧光RT ‑PCR检测： 吸取S3的裂解产物 （液体部分） ， 用引物及探针的荧光PCR试剂直接 进行检测。 权利要求书2页 说明书9页 序列表2页 附图3页 CN 115094161 A 2022.09.23 CN 115094161 A 1.一种丙肝病毒富集并实时荧光RT ‑PCR检测方法， 该方法用于非疾病诊断目的， 其特 征在于该 方法包括以下步骤： S1、 免疫磁珠的制备： 将丙肝病毒抗体偶联至羧基修饰的超顺纳米磁珠上， 得到偶联丙 肝病毒抗体的免疫磁珠； S2、 丙肝病毒阳性样本的富集： 将丙肝病毒阳性血清或血浆与偶联丙肝病毒抗体的免 疫磁珠混合， 孵 育； S3、 富集后的丙肝病毒 的分离： 用磁性工具分离免疫磁珠 ‑病毒复合物， 将其重悬于TE 缓冲液中加热裂解， 得到丙肝病毒的裂解产物； S4、 实时荧光RT ‑PCR检测： 吸取S3的裂解产物， 用包含以下引物及探针 的荧光PCR试剂 直接进行检测： 2.根据权利 要求1所述的丙肝病毒富集并实时荧光RT ‑PCR检测方法， 其特征在于： 所述 丙肝病毒抗体为单 克隆丙肝病毒表面 抗体。 3.根据权利 要求1所述的丙肝病毒富集并实时荧光RT ‑PCR检测方法， 其特征在于： S1所 述丙肝病毒的富集具体方法为： 取200 ‑600 μL血清或血浆与2 ‑5 μL免疫磁珠混合， 25 ‑37℃混 匀6‑15分钟。 4.根据权利 要求1所述的丙肝病毒富集并实时荧光RT ‑PCR检测方法， 其特征在于： S3所 述的加热裂解是： 在85 ‑95℃加热5 ‑15分钟裂解病毒释放核酸。 5.根据权利 要求1所述的丙肝病毒富集并实时荧光RT ‑PCR检测方法， 其特征在于： S4所 述荧光PCR试剂还 包含： (1)终浓度5 ‑15 μg/mL的Car rier RNA， (2)终浓度0.01 ‑0.15M的tris， (3)终浓度0.1％ ‑1％的吐温 ‑20，权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115094161 A 2(4)终浓度0.1 ‑2M的甜菜碱， (5)终浓度0.1 ‑0.5M的海藻糖， (6)终浓度0.1 ‑5m M的TCEP。 6.根据权利 要求5所述的丙肝病毒富集并实时荧光RT ‑PCR检测方法， 其特征在于： 所述 荧光PCR试剂总反应 体积≤40 μL。 7.根据权利 要求1所述的丙肝病毒富集并实时荧光RT ‑PCR检测方法， 其特征在于： 所述 超顺纳米 磁珠直径为20 0nm‑350nm， 表面带有羧基( ‑COOH)基团； 所述免疫磁珠制备具体为： 利用EDC活化法将抗单克隆丙肝病毒表面抗体连接到表面 带羧基(‑COOH)的超顺纳米 磁珠表面， 并用BSA对偶联了抗体后的磁珠进行封闭。 8.根据权利 要求1所述的丙肝病毒富集并实时荧光RT ‑PCR检测方法， 其特征在于： 所述 免疫磁珠的风干 保存方法为： 将免疫磁珠置于烘箱中， 将温度调至30℃ ‑37℃， 开启通风， 静 置10小时以上后取 出， 于2‑8℃密封保存。 9.一种用于丙肝病毒实时荧光RT ‑PCR检测的引物组合物， 其特征在于： 该引物组合物 包含以下引物及探针： 10.一种用于丙肝病毒实时荧光RT ‑PCR检测的荧光PCR试剂， 其特征在于该荧光PCR试 剂包含权利要求9所述的引物组合物以及： (1)终浓度5 ‑15 μg/mL的Car rier RNA， (2)终浓度0.01 ‑0.15M的tris， (3)终浓度0.1％ ‑1％的吐温 ‑20， (4)终浓度0.1 ‑2M的甜菜碱， (5)终浓度0.1 ‑0.5M的海藻糖， (6)终浓度0.1 ‑5m M的TCEP。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115094161 A 3