(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210335415.9 (22)申请日 2022.03.31 (71)申请人 浙江科技学院 地址 310023 浙江省杭州市西湖区留和路 318号 (72)发明人 李元源　胡可顺　王丰　陈宇菱　 (74)专利代理 机构 杭州天勤知识产权代理有限 公司 33224 专利代理师 沈金龙 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种虾肝肠胞虫分子信标环介导等温扩增 检测用的试剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种虾肝肠胞虫分子信标环 介导等温扩增检测用的试剂盒及检测方法。 本发 明通过设计一组MB ‑LAMP用的引物组， 为六条特 异性引物和一条特异性检测扩增序列的分子信 标， 在LAMP引物扩增特异性的基础上 实现检测特 异性， 大大降低了如染料法等间接性质的检测方 法所带来的的假阳性； 最低检测极限可达到1fg/ μL。 本发明检测方法鉴定简便， 通过加入的分子 信标与扩增靶序列的特异性结合产生荧光信号， 并根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结 果， 无需电泳等其他任何分析步骤， 适合现场检 测。 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 附图3页 CN 114891911 A 2022.08.12 CN 114891911 A 1.一种虾肝肠胞虫分子信标环介导等温扩增检测用的核酸序列组合， 其特征在于， 包 括： 一对外引物F3和B3、 一对内引物FIP和BIP、 一对环引物LF和LB， 以及分子信标MB， 序列分 别为： 外引物F3： 5 ’ ‑GATGCTTGGTGTGGGAGAA‑3’； 外引物B3： 5 ’ ‑CCCCCCATCAATTTCCAACG‑3’； 内引物FIP： 5 ’ ‑TCCTGGTAGTGTC CTTCCGTCATTTTTTTTCGGGCTCTGGGGATA‑3’； 内引物BIP： 5 ’ ‑AACGCGGGAAAACTTACCAGGGTTTTGCACCACTCTTGTCTACCTC‑3’； 环引物LF： 5 ’ ‑TCACCCTTGCGAGCGTAC ‑3’； 环引物LB： 5 ’ ‑TCAAGTCTATCGTAGAT TGGAGACA‑3’； 分子信标MB： 5’ ‑FAM‑GTACGCTTCACCCTTGCGAGCGTAC ‑DABCYL‑3’， 且分子信 标MB的5’端 和3’端分别标记了荧光基团和淬灭基团， 5 ’端的6个外加碱基和 3’端的6个碱基完全互补， 形成茎环结构， 3 ’端的19个碱基于环引物LF相同， 互补于靶序列。 2.根据权利 要求1所述核酸序列组合， 其特征在于， 分子信标MB上的荧光基团为FAM， 淬 灭基团为DABC YL。 3.一种虾肝肠胞虫分子信标环介导等温扩增检测用的试剂盒， 其特征在于， 包括权利 要求1所述的核酸序列组合。 4.根据权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 还包括阳性对照和阴性对照， 阳性对照 包含SEQ ID No.1所示序列的质粒， 阴性对照为无核酸的超纯 水。 5.权利要求3或4所述试剂盒在虾肝肠胞 虫分子信标环介导 等温扩增检测中的应用。 6.一种非疾病 诊断为目的的虾肝肠胞虫分子信标环介导等温扩增检测方法， 其特征在 于， 使用权利要求3或4所述的试剂盒， 检测方法包括以下步骤： (1)提取待检测样品的DNA； (2)以步骤(1)提取的DNA为模板， 使用权利 要求1中核酸序列组合进行分子信标环介导 等温扩增反应； (3)根据步骤(2)反应结果， 出现扩增曲线的为阳性， 否则为阴性。 7.根据权利要求6所述虾肝肠胞虫分子信标环介导等温扩增检测方法， 其特征在于， 步 骤(2)中分子信标环介导等温扩增反应体系为： 10 ×ThermoPol反应缓冲液2.5μL， 10mM   dNTP 3.5 μL， 100mM  MgSO4水溶液1.5 μL， 10 μM  FIP 0.8 μL， 10 μM  BIP0.8 μL， 10 μM  F3 0.1 μL， 10 μM B3 0.1 μL， 10 μM  LF 0.4 μL， 10 μM  LB 0.4 μL， 10 μMMB  0.5 μL， Bst  DNA聚合酶1.5 μL， DNA 模板1 μL， 用d dH2O补至25 μL。 8.根据权利要求6所述虾肝肠胞虫分子信标环介导等温扩增检测方法， 其特征在于， 步 骤(2)中分子信标环介导等温扩增反应程序为： 63℃预变性1s； 63℃变性45s； 63℃退火、 延 伸15s； 总共40个 循环。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114891911 A 2一种虾肝肠胞虫分子信标环 介导等温扩增检测用的试剂盒及 检测方法 技术领域 [0001]本发明涉及 生物技术领域， 特别是涉及一种虾肝肠胞虫分子信标环介 导等温扩增 检测用的试剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]虾肝肠胞虫(Enterocytozoon  hepatopenaei， EHP)是微孢子虫的一种， 属于肠胞 虫科， 是一种单细胞的真核内寄生虫， 广泛寄生于虾、 甲壳类等动物。 其 感染途径较广， 可通 过污染的养殖水体和病虾进 行水平传播， 也可以通过受精卵和虾苗进 行垂直传播。 EHP感染 的对虾初期没有明显症状， 但随着病程的发展体色、 胃和肠均表现出明显异常， 体色发白、 肠道吸收功能下降， 严重的出现肝胰腺萎缩， 个别虾体还会出现白便症状。 由于该病在早期 难以发现， 往往要养殖30～45d以上才会表现出生长缓慢， 不长个的现象， 因此极易造成饲 料空耗， 给养殖户带来巨大 的经济损失。 对于该病的防治方法， 国内外学者普遍认为， 综合 预防是相对有效的方法， 即尽早发现疾病并采取诸多措施阻止病毒传播。 因此， 建立灵敏、 准确、 快捷、 方便的E HP病原检测方法是减少虹彩病发生和危害的重要途径。 [0003]目前， 对于对虾是否感染肠胞虫病毒的检验的黄金标准仍然是实时荧光定量PC R， 然而该方法的执行需要昂贵的温控设备， 且频繁的温度循环需要耗费大量的时间， 很难适 应当前快速、 准确检测的需要。 [0004]环介导等温扩增技术(1oop ‑mediated  isothermal  amplification， LAMP)是 Notomi于2000年开发的一种恒温核酸扩增方法， 其特点是针对靶基因的6个区域设计4 ‑6条 特异引物， 利用一种链置换DNA聚合酶(B st DNApolymerase)在等温条件(60 ‑65℃左右)下 放置30‑60min， 即可完成核酸扩增反应。 作为一种简单、 快速、 成本低、 特异性强的检测技 术， 已在食品安全、 微 生物检验、 临床诊断等方面得到 了广泛应用。 [0005]LAMP技术应用于临床的最大问题在于其多采用观测焦磷酸镁白色沉淀、 HNB染料 颜色、 钙黄绿素荧光等方法判断阳性， 但上述方法的阳性检测结果只能代表实验过程中发 生了LAMP反应过程， 而无法区分真正的由引物和对应目标DNA模板杂交而形成的阳性扩增 结果和由于引物之 间、 引物与样 本DNA之间误杂交发生误扩增所导致的假阳性结果， 对临床 检测造成了不便 。 [0006]分子信标(molecular  beacon， MB)是1996年Tyagi等发明的一种有茎环结构的荧 光探针。 当没有靶序列存在时， 分子信标探针低温时自身闭合， 荧光基团和淬灭基团在空间 上相互靠近， 荧光淬灭。 而在有靶序列存在的情况下， 分子信标与互补的靶序列形成稳定的 双链杂交体， 使荧光基团和淬灭基团在空间上相互分离， 从而发出荧光信号， 在LAMP扩增的 过程中， 随着 循环次数的增加， 与模板结合的分子信标的量亦增加， 最 终的荧光强度与扩增 的模板量成正比， 因此通过对反应体系荧光值的观测， 即可判断是否存在 靶序列的扩增。 该 技术具有极高的特异性， 而且与LAMP的结合避免了复杂昂贵的仪器、 操作简便、 灵敏度高， 特别是适用于当前 快速诊断的需求。说　明　书 1/6 页 3 CN 114891911 A 3