(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210333373.5 (22)申请日 2022.03.31 (71)申请人 湖北省烟草科学研究院 地址 430030 湖北省武汉市硚口区宝丰路6 号香溢大酒店4楼 (72)发明人 李锡宏　许汝冰　黎妍妍　 (74)专利代理 机构 南京纵横知识产权代理有限 公司 32224 专利代理师 徐瑛 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01) A01G 13/00(2006.01) (54)发明名称 特异性抗烟草CMV病毒的dsRNA及其体外合 成引物和抗病性的应用 (57)摘要 本发明提供了一种特异性抗烟草CMV病毒的 dsRNA及其体外合成引物和抗病性的应用， 属于 基因突变或遗传工程和烟草病虫害防治技术领 域。 本发明利用RNA沉默的原理， 利用CMV病毒自 身MP基因体外合成了一种能够特异性抗CMV病毒 的dsRNA， 该dsRNA的核苷酸序列如SEQ  ID No.1 所示。 本发明还提供了 该dsRNA在烟草CMV病毒防 治时的应用方法， 为烟草CMV病毒防治提供新思 路， 避免了化学用药的诸多弊端； 该方法简单有 效， 不存在转基因安全风险， 更容易进行大田推 广应用。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图2页 CN 114807130 A 2022.07.29 CN 114807130 A 1.一种特异性抗烟草CMV病毒的dsRNA， 其特征在于， 所述dsRNA的核苷酸序列如SEQ  ID  No.1所示。 2.一种用于体外合成权利要求1所述的特异性抗烟草CMV病毒 的dsRNA的引物对， 其特 征在于， 正向引物CMP ‑F的核苷酸序列如SEQ  ID No.2所示， 反向引物CMP ‑R的核苷酸序列如 SEQ ID No.3所示。 3.根据权利要求2所述的引物对， 其特征在于， 分别在所述正向引物和所述反向引物的 5'端添加了T7启动子序列； 添加了T7启动子序列的正向引物CMP ‑T7F的核苷酸序列如SEQ   ID No.4所示， 添加了T7启动子序列的反向引物C MP‑T7R的核苷酸序列如SEQ  ID No.5所示。 4.权利要求1所述的特异性抗烟草CMV病毒的dsRNA的制备方法， 其特征在于， 包括以下 步骤： S1、 从感染CMV病毒的烟株叶片中提取烟草CMV病毒的总RNA， 以所述总RNA为模板， 反转 录获得病毒样本的cDNA； S2、 以步骤S1所 得cDNA为模板进行PCR扩增， 纯化回收目的片段； S3、 将步骤S2纯化回收的目的片段连接至载体上， 再将载体转入感受态细胞中， 培养、 扩增、 诱导表达， 挑取阳性克隆的MP蛋白进行测序， 得到如SEQ  ID No.6所示的MP蛋白的核 苷酸序列； S4、 将如SEQ  ID No.6所示的MP蛋白的核苷酸序列与已有的CMV病毒的MP蛋白的核苷酸 序列进行比对， 选取保守性较高区域的核苷 酸序列作为模板， 设计如SEQ  ID No.2和SEQ  ID  No.3所示的引物对， 然后转录合 成正义链ssRNA和反义链ssRNA， 将所述正义链ssRNA和反义 链ssRNA退火、 纯化得到所述dsRNA。 5.根据权利要求4所述的制备方法， 其特征在于， 步骤S2中PCR扩增的引物对为核苷酸 序列如SEQ  ID No.7所示的正向引物CMV ‑MP‑F和核苷酸序列如SEQ  ID No.8所示的反 向引 物CMV‑MP‑R。 6.根据权利要求4所述的制备方法， 其特征在于， 步骤S2中PCR扩增的反应体系为： 5μL 含MgCl2的10×PCR Buffer， 1 μL  10 μmol/L  dNTPs， 1 μL  10 μmol/L正向引物， 1 μL 10 μmol/L反 向引物， 2 μL  cDNA， 4U Taq DNA聚合酶， 加灭菌ddH2O补至总体积 为50 μL； PCR扩增程序为： 94 ℃预变性5mi n， 94℃变性1mi n， 58℃退火45s， 72℃延伸1mi n， 循环30次后72℃延伸10mi n。 7.根据权利要求4所述的制备方法， 其特征在于， 步骤S3的方法具体为： 将步骤2中得到 的目的片段连接至pMD ‑19T载体上， 在16℃反应4h， 将得到的重组载体转入DH5α 感受态细胞 中， 冰上孵育30min后， 在42℃下热激转化90s， 加入液体LB培养液， 置于37℃下200rpm的摇 床中摇菌2h； 吸取菌液至含有100mg/mL氨苄西林的LB固体培养基中， 37℃培养过夜； 挑取阳 性克隆进行测序， 得到如SEQ  ID No.6所示的MP蛋白的核苷酸序列。 8.权利要求1所述的特异性抗烟草CMV病毒的dsRNA的应用， 其特征在于， 将所述dsRNA 用于防治烟草C MV病毒。 9.根据权利 要求8所述的应用， 其特征在于， 取所述特异性抗烟草CMV病毒的dsRNA与用 于CMV病毒接种的缓冲液混合配制成dsRNA溶液， 将所述dsRNA溶液通过 喷施或涂抹的方式 接种到烟叶上。 10.根据权利要求9所述的应用， 其特征在于， 所述dsRNA溶液的用法为按照每叶20μg   dsRNA的量将所述dsRNA溶 液喷施于烟叶上。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807130 A 2特异性抗烟草 CMV病毒的dsRNA及其体外合成引物和抗病性的 应用 技术领域 [0001]本发明属于基 因突变或遗传工程和烟草病虫害防治技术领域， 具体涉及一种特异 性抗烟草CMV病毒的dsRNA及其体外合成引物和抗病性的应用。 背景技术 [0002]烟草(Nicotiana  tabacum L.)病毒病是普遍发生且危害严重的侵染性病害， 其种 类多， 分布广。 黄瓜花叶病毒(cucumber  mosaic virus， CMV)是我国烟草上的重要病害， 每 年造成的损失位于十大烟草侵染性病害名单前列。 CMV在烟草苗期和成株期均可感染， 以大 田成株期发病较多， 且CMV往往与其他病毒混合 发生。 烟叶感染CMV病毒后， 初期叶脉呈半透 明状， 逐渐表现为浓淡不均的黄绿相间的花叶症状， 叶脉附近的叶肉突起， 呈浓绿泡斑， 叶 片变窄、 扭曲畸形， 叶尖细长， 呈鼠尾状， 叶基伸长， 表面茸毛易脱落无光泽， 严重影响了烟 叶的质量和产量。 生产上主要采 取治虫防病、 药剂防治等措施防治， 防治效果不高， 因此CMV 的防控仍然是烟叶生产中的一个热点和难点。 [0003]CMV基因组由三条线形正义ssRNA组成， 其中RNA1长约3357nt， RNA2长约3050nt， RNA3长约2216nt， RNA4是亚基因组RNA， 长约1000nt。 在3条RNA片段上共有5个开放阅读框 (Open Reading Frame， ORF)， 分别编码5个蛋白： RNA1负责编码la蛋白， 该蛋白为病毒RNA复 制酶亚基， 含有甲基转移酶和解旋酶 的功能域； RNA2编码2a和2b蛋白， 其中2a蛋白为RNA聚 合酶(RNA ‑dependent  RNA polymerase， RdRp)， 2b蛋白由亚基因组RNA4A编码， 它与病毒的 长距离移动、 寄主特异性以及基因沉默的抑制有关； RNA3编码3a蛋白(Movement  protein， MP)和外壳蛋白(Coat  protein， CP)， 它们 与病毒在寄主体内的胞间移动和长距离移动密切 相关。 在3a  ORF和CP ORF间有一段非编码序列， 具有亚基因组RNA启动子功能， 该启动子的 作用是可以产生大量具有编码CP功能的亚基因组RNA4， 即CP是由亚基因组RNA4编码产生。 CMV基因组RNA1、 RNA2和RNA3均为病毒侵染所必需的基因。 其中RNA3编码的移动蛋白MP与病 毒在寄主体内的胞间移动和长距离移动密切相关， 其编码基因是CMV病毒病生物防治的一 个理想靶基因。 [0004]近年来， RNA干扰技术(RNA  interference， RNA i)在作物抗病虫害领域逐渐崭露头 角。 RNAi是指在转录后通过RNA调控基因表达， 在真核细胞中引入双链RNA(dsRNA)分子从而 导致具有序列同源性的基因产生特异性基因沉默(gene  silencing)的现象。 当真核细胞内 出现双链RNA(dsRNA)， 胞质中的核酸内切酶Dicer便将其切割成长度为21～23bp的小片段 RNA(siRNA)。 在RNA解旋酶的作用下， siRNA双链被解开形成正义链和反义链。 此刻出现的反 义链随后与内切、 外切酶及解旋酶等结合形成具有核酸酶功能的RNA诱导的沉默复合物 (RNA‑induced silencing  complex， RISC)。 RISC与mRNA中的同源区特异性结合并在与 siRNA反义链互补结合的两端切割mRNA， mRNA一旦以此被切割便立即被降解。 通过这种方 式， dsRNA引发了细胞对其同源靶基因RNA的降解反应。 目前， 已有研究(Konakalla  NC, Kaldis A,Berbati  M,et al.Exogenous  application  of double‑stranded  RNA 说　明　书 1/7 页 3 CN 114807130 A 3