(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210328289.4 (22)申请日 2022.03.31 (71)申请人 中国疾病预防控制中心传染病预防 控制所 地址 102206 北京市昌平区昌百路15 5号 (72)发明人 赵硕　阚飙　张京云　吴斌　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/06(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 应用数字PCR对霍乱弧菌活的非可培养状态 细胞进行检测 和绝对定量的方法 (57)摘要 本发明涉及微生物学技术领域， 尤其涉及应 用数字PCR对霍乱弧菌活的非可培养状态细胞进 行检测和绝对定量的方法。 所述方法包括检测经 过PMA处理的待检测霍乱弧菌样本中VC1376、 thyA或recA中一种或多种基因的拷贝数， 根据检 测结果判断所述霍乱弧菌VBNC状态细胞的量。 本 发明针对霍乱弧菌VC1376、 t hyA或recA三个基因 进行检测， 结合数字PCR可以有效反映出霍乱弧 菌VBNC状态细胞的数量， 具备较高的检测率和稳 定性， 同时检测限较低， 这在VBNC状态细胞检测 领域具有重要意 义。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图2页 CN 114410757 A 2022.04.29 CN 114410757 A 1.应用数字PCR对霍乱弧菌活的非可培养状态细胞进行检测和绝对定量的方法， 其特 征在于， 包括： 检测经过PMA处理的待检测霍乱弧菌样本中VC1376、 thyA或recA中一种 或多种基因的 拷贝数， 根据检测结果判断所述霍乱弧菌VBNC状态细胞的量。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， VC1376包括如SEQ  ID NO.1所示的核苷酸 序列； 和/或， thyA包括如SEQ  ID NO.2所示的核苷酸序列； 和/或， recA包括如SEQ  ID NO.3 所示的核苷酸序列。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 其特 征在于， 采用如下引物对检测VC1376的拷贝数： VC1376‑F： 5’ ‑TAACATAATAAGGAAGAAGTGGAT‑3’， VC1376‑R： 5’ ‑ACAGTCAGA AGCAGAGA A‑3’； 和/或， 采用如下引物对检测thyA的拷贝数： thyA‑F： 5’ ‑  ACATGGGACGCGTGTATG G‑3’， thyA‑R： 5’ ‑  ATATGACCACCATCAGGCTTAGC‑3’； 和/或， 采用如下引物对检测recA的拷贝数： RecA‑F： 5’ ‑  GTGCTGTG GATGTCATCGT TGTTG‑3’， RecA‑R： 5’ ‑CCACCACTTCTTCGCCTTCTTTGA‑3’。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 通过荧光定量PCR或数字PCR检测经过PMA 处理的待检测霍乱弧菌样本中VC1376、 thyA和recA基因的拷贝数。 5.根据权利要求 4所述的方法， 其特 征在于， 所述qPCR的反应程序为： 95℃， 3 min; 95℃， 5 s， 50°C 30s， 54℃ 30s， 55℃ 30s， 循环40次； 和/或， 所述ddPCR的反应程序为95℃,5min;  95℃， 30s， 50℃， 54℃  30s， 55℃  30s; 4℃， 5min， 90℃， 5mi n。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于， 所述PMA处 理包括如下流 程： 将所述待检测霍乱弧菌样本置于4℃条件下， 采用20~30mM的PMA处理20~30分钟， 然后 采用卤素灯在冰上照射15~25分钟。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所用PMA浓度为20mM； 和/或， PMA处理时间 为20分钟。 8.一种引物组合， 其特 征在于， 包括如下三对引物中的任意 一种或多种： i） VC1376 ‑F： 5’ ‑TAACATAATAAGGAAGAAGTGGAT‑3’， VC1376‑R： 5’ ‑ACAGTCAGA AGCAGAGA A‑3’； ii） thyA‑F： 5’ ‑  ACATGGGACGCGTGTATG G‑3’， thyA‑R： 5’ ‑  ATATGACCACCATCAGGCTTAGC‑3’； iii） RecA‑F： 5’ ‑  GTGCTGTG GATGTCATCGT TGTTG‑3’， RecA‑R： 5’ ‑CCACCACTTCTTCGCCTTCTTTGA‑3’。 9.一种试剂盒， 其特 征在于， 包括权利要求8所述的引物组合。 10.权利要求8所述的引物组合， 或权利要求9所述的试剂盒在检测霍乱弧菌VBNC状态 细胞中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114410757 A 2应用数字PCR对霍乱弧菌活的非可培养状态细胞进行检测和 绝对定量的方 法 技术领域 [0001]本发明涉及微生物学技术领域， 尤其涉及应用数字PCR对霍乱弧菌活的非可培养 状态细胞进行检测 和绝对定量的方法。 背景技术 [0002]霍乱弧菌是革兰氏阴性菌， 菌体短小呈逗点状， 有单鞭毛、 菌毛， 部分有荚膜。 当细 菌暴露于不利环境如低温、 低营养、 辐射、 抗生素等时， 细菌进入VBNC状态。 在这种状态下， 细菌不能在常规培养基上生长但是仍处于存活状态， 这种状态被称为活的非可培养 （VBNC） 状态。 而且当恢复到有利环境时， VBNC  细胞能够复苏到可培 养状态。 [0003]VBNC细胞的鉴定、 检测和绝对定量对于微生物研究和疾病监测 与防控都是必不可 少的。 因为它们不可培养的特性， 传统的计数方法无法对VBNC细胞进 行定量检测， 例如传统 的基于形态学和显微镜计数无法区分活、 死细胞。 现有技术中虽然有专利提出能够定量检 测大肠杆菌VBNC状态， 但是不能连续动态监测定量VBNC拷贝数， 而且不适用于霍乱弧菌 VBNC状态的检测与鉴定 。 发明内容 [0004]为了解决现有技术存在的问题， 本 发明提供一种定量检测霍乱弧菌VBNC状态细胞 的方法。 通过VC1376、 thyA或recA 基因对霍乱弧菌VBNC状态细胞进行检测， 可以准确反应其 实际数量。 [0005]第一方面， 本发明提供一种定量检测霍乱弧菌VBNC状态细胞的方法， 包括： 检测经过PMA处理的待检测霍乱弧菌样本中VC1376、 thyA或recA中一种或多种基 因的拷贝数， 根据检测结果判断所述霍乱弧菌VBNC状态细胞的量。 [0006]进一步地， VC1376包括如SEQ  ID NO.1所示的核苷酸序列； 和/或， thyA包括如SEQ   ID NO.2所示的核苷酸序列； 和/或， recA蛋白包括如SEQ  ID NO.3所示的氨基酸序列。 全基 因组序列参照NC_002505.1  Vibrio cholerae  O1 biovar El Tor str. N16961  chromosome  I, complete sequence。 [0007]进一步地， 采用如下引物对检测VC1376蛋白的拷贝数： VC1376‑F： 5’ ‑TAACATAATAAGGAAGAAGTGGAT‑3’， VC1376‑R： 5’ ‑ACAGTCAGA AGCAGAGA A‑3’； 采用如下引物对检测thyA蛋白的拷贝数： thyA‑F： 5’ ‑  ACATGGGACGCGTGTATG G‑3’， thyA‑R： 5’ ‑  ATATGACCACCATCAGGCTTAGC‑3’； 采用如下引物对检测recA蛋白的拷贝数： RecA‑F： 5’ ‑  GTGCTGTG GATGTCATCGT TGTTG‑3’， RecA‑R： 5’ ‑CCACCACTTCTTCGCCTTCTTTGA‑3’。说　明　书 1/7 页 3 CN 114410757 A 3