(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210345971.4 (22)申请日 2022.03.31 (71)申请人 河南冠宇仪 器有限公司 地址 450000 河南省郑州市新郑市薛店镇 中德产业园39- 3栋 申请人 河南中检食安 生物科技有限公司 (72)发明人 许世伟　许远　邵俊影　吴镇宇　 王欣　林圣博　 (74)专利代理 机构 成都顶峰专利事务所(普通 合伙) 51224 专利代理师 钱学宇 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/04(2006.01)C12N 15/11(2006.01) F26B 5/06(2006.01) (54)发明名称 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测引物组、 试剂盒以及冻干微球的制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 的LAMP检测引物组、 试剂盒以及冻干微球的制备 方法， 属于核酸检测领域。 该检测引物组针对唐 菖蒲伯克霍尔德氏菌的16S～2 3S rRNA保守序列 设计， 检测引物组包括外引物F3、 外引物B3、 内引 物FIP、 内引物BIP、 环引物LF和环引物LB。 包含 这 种检测引物组的冻干微球的制备方法包括： 将上 述检测引物组与LA MP反应基液混合， 得到扩增反 应体系； 将扩增反应体系与冻干保护剂混合， 逐 滴滴入液氮中速冻成球后， 冷冻干燥。 这种检测 方法， 利用上述冻干微球， 能够简单、 高效的检测 出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌存在与否， 进而判断出 检测样本中是否含有米酵菌酸毒素， 特异性强， 不易出现假阳性。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图3页 CN 114525324 A 2022.05.24 CN 114525324 A 1.一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测引物组， 其特征在于， 所述检测引物组针对 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的16S～23S  rRNA保守序列设计， 所述检测引物组包括外引物F3、 外 引物B3、 内引物FIP、 内引物BIP、 环引物LF和环引物LB； 所述外引物F3的核苷酸序列如SEQ  ID NO.1所示； 所述外引物B3的核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示； 所述内引物FIP的核苷酸序列如SEQ  ID NO.3所示； 所述内引物BIP的核苷酸序列如SEQ  ID NO.4所示； 所述环引物LF的核苷酸序列如SEQ  ID NO.5所示； 所述环引物LB的核苷酸序列如SEQ  ID NO.6所示。 2.根据权利要求1所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测引物 组， 其特征在于， 所述 外引物F3和所述外引物B3的浓度均为0.15～0.25 μM， 所述内引物FIP与所述内引物BIP的浓 度均为1.5～1.7 μM， 所述环引物LF和环引物LB的浓度为0.4～0.8 μM 。 3.一种用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的冻干微球的制备 方法， 其特 征在于， 其包括： 将如权利要求1或2所述的检测引物组与LAMP反应 基液混合， 得到扩增反应 体系； 将所述扩增反应体系与冻干保护剂混合， 逐滴滴入液氮中， 控制每个液滴的体积为23 ～28 μL， 速冻成球后， 冷冻干燥。 4.根据权利要求3所述的冻干微球的制备方法， 其特征在于， 所述冷冻干燥的步骤包 括： 将在液氮中形成的微球于 ‑50～60℃下进行第一次干燥8～16h后， 在20～30℃下进 行二 次升华干燥 4‑10h。 5.根据权利要求3所述的冻干微球的制备方法， 其特征在于， 所述冻干保护剂包括海藻 糖、 PEG20 000和甘氨酸中的至少一种。 6.根据权利要求5所述的冻干微球的制备方法， 其特征在于， 所述冻干保护剂是通过质 量分数为65％～75％的海藻糖、 质量分数为6％～10％的甘氨酸以及质量分数为20％～ 30％的PEG20 000按照体积比2:3:6混合所 得。 7.根据权利要求3所述的冻干微球的制备方法， 其特征在于， 所述LAMP反应基液包括： DNA聚合酶、 dNTPs、 MgSO4、 显色剂、 甜菜碱、 pH调节剂、 d dH2O和buffer。 8.根据权利要求7所述的冻干微球的制备方法， 其特征在于， 所述显色剂为酚红、 甲酚 或中性红。 9.一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括如权 利要求3～8任一项所述的制备 方法制得的冻干微球。 10.一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测方法， 其特征在于， 其利用如权利要求9所 述的检测试剂盒进行检测， 包括： 将所述冻干微球复溶后， 形成LAMP反应 体系； 将来自待测样品中的模板DNA与所述LAMP反应体系混合， 于60～65℃下反应50～ 70min， 进行LAMP扩增。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114525324 A 2唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测引物组、 试剂盒以及冻干 微球的制备方 法 技术领域 [0001]本发明属于基因检测技术领域， 具体涉及一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测 引物组、 试剂盒以及冻干微球的制备 方法。 背景技术 [0002]唐菖蒲伯克霍尔德氏菌为革兰氏阴性短杆菌、 两端钝圆， 无牙孢， 有鞭毛， 在自然 界分布广泛。 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌为兼性厌氧， 易在 食品表面生长。 唐菖蒲伯克霍尔德氏 菌可以产生米酵菌酸引起食物中毒， 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌不耐 高温， 很容易被高温杀死， 但是它所产生的 “米酵菌酸 ”毒素耐热， 一般烹调方法不能破坏其毒性。 由于唐菖蒲伯克霍 尔德氏菌食物中毒流行规模较大、 发病率和病死率极高， 而且目前缺乏特效的解毒措施。 因 此唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的检测方法是否 灵敏、 快速 至关重要。 [0003]目前米酵菌酸的检测方法的依据是GB  5009.189 ‑2016 《食品安全国家 标准食品中 米酵菌酸的测定》 ， 用的是高相液相色谱法检测， 检测的仪器及试剂成本非常相对较高， 除 此以外也有用薄层层析、 紫外分光光度、 ELISA、 胶体金试纸条等方法检测 唐菖蒲伯克霍尔 德氏菌所产生的外毒素的。 这些 方法虽然操作相对简单一些， 但很容 易出现假阳性现象。 [0004]环介导恒温扩增技术是一种不需要精确控温过程的基因诊断技术， 借助6条特异 性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶， 可在等温条件 下快速， 高特异 性和灵敏的扩增 靶序列， 检测全 过程只需要在60 ‑65℃条件下扩增40 ‑60min， 具有操作简单、 反应时间短、 特 异性高、 灵敏度高等特点， 广泛应用于病原菌检测领域。 [0005]环介导恒温扩增法结果判读 方法主要有1： 浊度法， 可通过反应后肉眼观察是否存 在白色絮状沉淀， 判定检测结果， 主观因素较强， 灵敏度低。 2、 显 色法， 反应结束后加入核酸 染料SYBR  GREEN、 HNB、 钙黄绿素等， 在紫外灯或肉眼条件下显示不同的颜色， 结果判定简 单， 但需要反应结束后开盖， 极易造成气溶胶污染。 3、 荧光检测法， 该方法通过向反应体系 中加入荧光染料SYB R GREEN， 通过荧光PCR仪可实时观察体系中荧光变化， 生成荧光曲线， 通过曲线观察扩增结果， 该方法闭管检测， 杜绝气溶胶污染， 但因SYBR  GREEN染料特性， 能 和任意的双链DNA结合， 并发生 荧光， 特异性低易出现假阳性。 发明内容 [0006]本发明的第一目的在于提供一种唐 菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测引物组， 该引 物组针对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的保守序列16S～23S  rRNA设计， 能够特异性的识别唐菖 蒲伯克霍尔德氏菌， 特异性强。 [0007]本发明的第二目的在于提供一种用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的冻干微球的 制备方法， 该方法采用冻干预混液的方式， 将所有的试剂包含在一个冻干微球中， 制备过程 简单， 冻干微球中试剂的稳定性 好。 [0008]本发明的第三目的在于提供一种唐 菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测试剂盒， 该试说　明　书 1/8 页 3 CN 114525324 A 3