(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210328511.0 (22)申请日 2022.03.30 (71)申请人 贵州傲农七环畜牧 养殖有限公司 地址 556100 贵州省黔 东南苗族侗族自治 州黄平县新州镇白塘村下坝组 申请人 漳浦县赵木兰养殖有限公司 　 南宁傲农育种技 术有限公司 　 福建傲农生物科技 集团股份有限公 司 (72)发明人 邓红玉　陈秀萍　刘娴　凌勇　 龙小敏　张正林　李亮　吴有林　 (74)专利代理 机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通 合伙) 11463 专利代理师 宋家会(51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6848(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/21(2006.01) (54)发明名称 一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合、 试剂盒及应用 (57)摘要 本发明公开了一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩 增引物组合、 试剂盒及应用， 涉及分子生物学技 术领域。 其包括第一引物对和第二引物对， 第一 引物对具有如SEQ  ID NO.1‑2所示的序列， 第二 引物对具有如SEQ  ID NO.3‑4所示的序列。 本发 明提供的巢式PCR扩增引物组合可以用于副猪嗜 血杆菌的快速检测， 具有较好的检测灵敏度和准 确度， 经验证， 本发明提供的扩增引物组合具有 较高的扩增灵敏度， 比普通PCR扩增的灵敏度高 100倍， 且该扩增引物 的特异性强， 重复性好， 可 以应用于猪场日常检测， 为副猪嗜血杆菌的临床 诊断提供技 术支持。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图3页 CN 114457177 A 2022.05.10 CN 114457177 A 1.一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物 组合， 其特征在于， 其包括第 一引物对和第二引 物对， 所述第一引物对具有如SEQ  ID NO.1‑2所示的序列， 所述第二引物对具有如SEQ  ID  NO.3‑4所示的序列。 2.一种试剂盒， 其特征在于， 其包括权利要求1所述的副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物 组合。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述试剂盒还 包括PCR反应预混液。 4.一种如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合在制备试剂盒中的应 用。 5.一种如权利要求1所述的副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合在制备检测测试样品 中副猪嗜血 杆菌的试剂盒中的应用。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于， 所述试剂盒用于： 将权利要求1所述的副猪 嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合与待测对象的基因 组DNA混合； 通过PCR扩增反应实现副猪嗜血 杆菌的检测。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特 征在于， 所述PCR扩增反应包括： 先以第一引物对对检测对象的基因组DNA进行普通PCR扩增获得扩增产物， 然后以所述 扩增产物为模板， 用第二引物对进行巢式PCR扩增。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述普通PCR扩增的反应程序为95℃1 ‑ 5min； 95℃30‑45s， 54.5 ‑57.5℃， 3 5s， 70‑72℃30s， 共30‑40个循环； 70‑72℃1‑10min； 优选地， 所述普通PCR扩增的反应程序为95℃1 ‑5min； 95℃30 ‑45s， 56.5℃， 35s， 70 ‑72 ℃30s， 共30‑40个循环； 70‑72℃1‑10min。 9.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述巢式PCR扩增的反应程序为95℃1 ‑ 5min； 95℃30‑45s， 55.5‑58.5℃， 3 5s， 70‑72℃30s， 共30‑40个循环； 70‑72℃1‑10min； 优选地， 所述巢式PCR扩增的反应程序为95℃1 ‑5min； 95℃30 ‑45s， 57.5℃， 35s， 70 ‑72 ℃30s， 共30‑40个循环； 70‑72℃1‑10min。 10.根据权利要求5 ‑9任一项所述的应用， 其特征在于， 所述应用还包括对巢式PCR扩增 后的产物进行电泳和/或测序。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114457177 A 2一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合、 试剂盒及应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学技术领域， 具体而 言， 涉及一种副猪嗜血杆菌巢式PC R扩增 引物组合、 试剂盒及应用。 背景技术 [0002]副猪嗜血杆菌病(Haemophilus  parasuis， HPS)又称为多发性浆膜炎、 关节炎， 致 病原为副猪嗜血杆菌， 主要危害断奶仔猪和保育猪， 是造成养猪场保育猪、 仔猪发病率、 死 亡率增加的主要细菌性疾病， 每年所造成的经济损失不可估量。 副猪嗜血杆菌是猪上呼吸 道定殖的一种菌群， 通常情况下猪群抵抗力较强时副猪嗜血杆菌不会产生致病性， 一旦受 到多种应激因素影响， 猪群抵抗力下降或免疫器功 能下降时， 该菌就会趁机大量繁殖并产 生毒素， 使猪出现严重的临床症状。 [0003]临床上结合患猪胸膜肺炎、 腹膜炎、 心包炎、 心脏表面有大量的绒毛， 可作出初步 的诊断。 而要确诊还需要 借助实验室检测方法。 目前主要的检测方法是将病料充分粉碎后， 进行涂片染色镜检； 或者将采集到的病 料进行分离培养， 将分离得到的病菌转移到血液琼 脂平板上， 然后再挑取金黄色葡萄球菌进行垂直划线接种， 培养36h后出现典型的卫星现 象， 即判断病料感染副猪嗜血 杆菌。 [0004]然而， 上述镜检和接种培养方法都存在方法上的繁琐问题， 而且容易误诊， 所以目 前很多对副猪嗜血杆菌的诊断选用分子生物学方法。 主要有普通P CR和荧光PCR， 而普通PCR 由于灵敏度有限因而在临床样 本的检测应用中的价值也有限， 荧光定量P CR由于易污染、 实 验成本和对实验场所要求较高等原因不 易在基层推广。 [0005]鉴于此， 特提出本发明。 发明内容 [0006]本发明的目的在于提供一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合、 试剂盒及应用 以解决上述 技术问题。 [0007]本发明是这样实现的： [0008]本发明提供了一种副猪嗜血杆菌巢式PCR扩增引物组合， 其包括第一引物对和第 二引物对， 第一引物对具有如SEQ  ID NO.1‑2所示的序列， 第二引物对具有如SEQ  ID NO.3‑ 4所示的序列。 [0009]巢式PCR是使用两对PCR引物进行扩增的方法， 第一对PCR引物扩增片段和普通PCR 相似； 而第二对引物即为巢式引物， 其结合在第一次PCR产 物的内部， 使 得第二次PCR扩增片 段短于第一次扩增片段， 该扩增方法可提高普通PCR检测的灵敏度和准确性。 [0010]发明人利用NCBI网站下载HPS的16S  rRNA基因序列(登录号： FJ667982)， 利用 Primer 5.0引物设计软件设计出了针对HPS的引物对， 经过筛选获得了可以用于巢式PCR扩 增的引物组合。 其中， 第一引物对用于第一次PCR扩增， 第二引物对用于巢式PCR扩增。 [0011]经验证， 本 发明提供的扩增引物组合具有较高的扩增灵敏度， 比普通PCR扩增的灵说　明　书 1/6 页 3 CN 114457177 A 3