(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210331156.2 (22)申请日 2022.03.30 (71)申请人 吉林大学 地址 130012 吉林省长 春市前进大街269 9 号 (72)发明人 宫鹏涛　李珊　曹松高　姜维娜　 李建华　张西臣　于艳辉　曹利利　 李新　王晓岑　 (74)专利代理 机构 北京和联顺知识产权代理有 限公司 1 1621 专利代理师 孙伟新 (51)Int.Cl. C12Q 1/6893(2018.01) C12Q 1/6804(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/90(2006.01) (54)发明名称 一种基于RPA -CRISPR-Cas12a体系可视化检 测阴道毛滴虫的试剂盒及方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于RPA ‑CRISPR‑Cas12a 体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒及方法， 所 述试剂盒包含一对用于扩增阴道毛滴虫actin基 因的特异性RPA引物对、 用于CRISPRCas12a反应 的crRNA、 荧光报告基团、 侧向流免疫层析报告基 团和Cas12/13通用侧流层析试纸条， 以及用于 CRISPR反应的缓冲液和Cas12a蛋白， 用于扩增阴 道毛滴虫actin基因的特异性RPA引物对的核苷 酸 序列如SEQI DNO :11 和1 6所示 ， 用于 CRISPRCas12a反应的crRNA互补的DNA的核苷酸 序列如SEQIDNO:5所示； 该方法快速、 可视， 且特 异性好， 敏感度高， 可作为一种临床检测阴道毛 滴虫的工具， 对设备要求较低， 特别适用于大规 模人群筛查， 为公共卫生机构的监测提供良好的 技术手段。 权利要求书1页 说明书10页 附图10页 CN 114774565 A 2022.07.22 CN 114774565 A 1.一种基于RPA ‑CRISPR‑Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的试剂盒， 包括试剂盒， 其 特征在于： 所述试剂盒包含一对用于扩增阴道毛滴虫actin基因的特异性RPA引物对、 用于 CRISPR Cas12a反应的crRNA、 荧光报告基团、 侧向流免疫层析报告基团和Cas12/13通用侧 流层析试纸条， 以及用于 CRISPR反应的缓冲液和Cas12a 蛋白。 2.根据权利要求1所述的一种基于RPA ‑CRISPR‑Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的 试剂盒， 其特 征在于： 所述Cas12a 蛋白为pGEX ‑4T‑1‑Cac12a重组蛋白。 3.根据权利要求1所述的一种基于RPA ‑CRISPR‑Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的 试剂盒， 其特征在于： 所述用于扩增阴道毛滴虫actin基因的特异性RPA引物对的核苷酸序 列如SEQ ID NO:11和16所示， 用于CRISPR  Cas12a反应的crRNA 互补的DNA的核苷酸序列如 SEQ ID NO:5所示。 4.根据权利要求1所述的一种基于RPA ‑CRISPR‑Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的 试剂盒及方法， 其特征在于： 所述用于CRISPR  Cas12a反应的crRNA的报告探针为含有TTATT 的单链DNA报告序列； 用于荧光检测时， 荧光报告探针为5 ′6‑FAM‑TTATT‑BHQ1‑3′， 用于侧向 流免疫层析检测时， 试纸条报告探针为5 ′6‑FAM‑TTATT‑Biotin‑3′。 5.根据权利要求1所述的一种基于RPA ‑CRISPR‑Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的 试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒检测阴道毛滴虫时， RPA反应体系20 μL： 其中包括RPA上游 扩增引物0.50 μM， RPA下游扩增引物0.50 μM， 1 ×Rehydration Buffer， MgOAc  14mM， 待检测 样本基因 组DNA2 μL， 其余用水补足至20 μL； RPA扩增程序为： 恒温37℃或39℃， 反应3 0min。 6.根据权利要求1所述的一种基于RPA ‑CRISPR‑Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的 试剂盒， 其特征在于： 所述用于CRISPR反应的缓冲液包括： Tris ‑HCl pH＝8.020mM、 KCl   100mM、 MgCl25mM、 DTT 1mM、 5％甘油、 肝素5 0 μg/mL。 7.根据权利要求1所述的一种基于RPA ‑CRISPR‑Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的 试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒检测阴道毛滴虫时， CRISPR  Cas12a检测体系50μL： 包含 100ng RPA扩增靶基因产物， crRNA2 50nM、 RNase  Inhibitor0.5 μL、 探针200nM、 Tris ‑HCl pH ＝8.020mM、 KCl  100mM、 MgCl25mM、 DTT1mM、 5％甘油、 肝素50μg/mL、 加ddH2O补足至50μL； CRISPR程序为： 使用EasyPGX定量PCR仪3 7℃反应40min， 每隔2min采集一次FA M荧光， 或在3 7 ℃水浴锅 反应1h后加入无酶水补足至80uL后滴加于CRISPR  Cas12a/Cas13a专用试纸条上 肉眼观察结果。 8.根据权利要求1所述的一种基于RPA ‑CRISPR‑Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的 方法， 其特征在于： 将RPA特异性扩增与crRNA特异性序列鉴定相结合， 使增强的Cas12a检测 更具特异性； 并在37℃条件下进行检测， 适合在缺乏PCR仪等仪器设备的实验室或现场使 用； 同时可以根据现有 条件选取荧光法(通过仪器或蓝光激发肉眼观察)或侧流层析试纸条 法(直接裸眼观察)。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774565 A 2一种基于R PA‑CRISPR‑Cas12a体系可视化检测阴道毛滴虫的 试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明涉及医学检测领域， 具体为一种基于RPA ‑CRISPR‑Cas12a体系可视化检测 阴道毛滴虫的试剂盒及方法。 背景技术 [0002]阴道毛滴虫(Trichomonas  vaginalis， TV)是一种胞外寄生虫， 属于单细胞鞭毛原 生动物寄生虫， 是一种微需氧寄生虫。 通过对上皮细胞的粘附作用， 从而寄生于宿 主的阴道 和尿道， TV的发病机制主要为： 寄生虫对宿主细胞的杀灭、 破坏阴道微生物稳态、 通过激活 宿主免疫反应引起炎症以及 免疫逃避反应等。 阴道毛滴虫侵入生殖系统或者泌尿系统后， 不论对男性或是女性都会诱发感染， 而造成较为严重的后果。 该病可表现出生殖器症状， 包 括阴道红斑、 瘙痒和气味， 产生灰绿或黄绿色分泌物， 排尿困难等。 在女性感染中阴道毛滴 虫除引起阴道炎外、 宫颈炎、 尿道炎、 不育等， 还与许多围产期并发症相关， 引起胎膜早破、 早产、 低体重儿等； 在男性感染中可引起阴道毛滴虫性疾病(包括非淋菌性尿道炎、 前列腺 炎等)， 同时阴道毛滴虫感染增加人类免疫缺陷病毒(HIV)  的传播， 并与宫颈癌和前列腺癌 的发病率和严重程度有关。 阴道毛滴虫是全世界最常见的非病毒性传播感染(STI)的病原 体， 每年将会引起大约2.7亿人感染， 然而， 没有表现出症状的感染比例估计在40％到80％ 之间， 因此有效的诊断手段对阴道毛滴虫的防治尤为重要。 [0003]目前常用的阴道毛滴虫诊断方法有培养法、 湿片镜检法等， 近年来也陆续开发出 酶联免疫法(ELISA)、 聚合 酶链反应(PCR)、 胶体金快速检测、 直接荧光抗体试验(DFA)、 胶乳 凝集试验(LAT)等用于检测阴道毛滴虫的方法。 临床上最常用的诊断方法是湿片 镜检法， 适 用于有感染、 分泌物、 瘙痒或阴道异味症状的妇女， 其操作简单、 省时， 但由于检测灵敏度跨 度比较大， 所以检测率浮动较大， 不适用于经验不丰富的检验 人员。 培养 法是目前临床诊断 上公认的金标准， 但其检测方法周期较长， 费时费力， 此外， 培养法和湿片镜检法都需要显 微镜人工检查， 不能实现自动化批量检测， 重复率较差。 聚合酶链式反应(polymerase   chain reaction， PCR)是一种灵敏度高、 特异性强、 反应迅速的诊断技术。 基于PCR技术已经 建立了多种方法用于诊断阴道毛滴虫及基因型的鉴定， 在P CR方法基础上， 通过引入荧光标 记的探针， 可以实时检测靶标的扩增情况， 称为Real  time PCR， 这种方法不仅是快速、 灵 敏， 同时也可以进 行定量分析， 这些方法无论在灵敏度还是在特异 性上， 都具有其它方法不 可比拟的优势， 然而这种方法操作比较繁琐， 不仅需要相关专 业操作培训， 还需采购体积 较 大、 价格昂贵的设备， 难以满足非实验室环境下现场检测的要求。 除了传统P CR， 环介导等温 扩增(LAMP)和重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase  Amplification， RPA)技 术也已被开 发用于检测动物病原体。 与传统  PCR相比， LAMP检测方法操作简单， 但反应中的 多对引物的加入使其可靠性降低， 可能产生假阳性检测结果。 RPA是一种新型的恒温核酸扩 增技术， 其最显著的优势就是可在37～42℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增， 可以在10 ～ 40min内完成数十亿的DN