(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210330412.6 (22)申请日 2022.03.30 (71)申请人 海南大学 地址 570000 海南省海口市人民大道58号 (72)发明人 罗杰　李名扬　王瑞　王玉慧　 郭志宇　 (74)专利代理 机构 苏州中合知识产权代理事务 所(普通合伙) 32266 专利代理师 刘召民 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒及方法 (57)摘要 本发明提供了快速检测东亚西番莲病毒的 试剂盒及方法， 简单易行， 具有灵敏度高、 特异性 强、 反应时间短(仅需30min)等特点， 可以实现常 温操作， 常温反应以及常温保存， 非常适合田间 大规模快速 检测。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 114934133 A 2022.08.23 CN 114934133 A 1.快速检测东 亚西番莲病毒的试剂盒， 包括： EAPV引物， 所述EAPV引物的序列为： EAPV‑F： 5′ ‑gattcaaatcttggaagatgacccatatatc c‑3′， EAPV‑R： 5′ ‑gtatgagtgtgattgtgatgggcaatccac‑3′。 2.根据权利要求1所述的快速检测东亚西番莲病 毒的试剂盒， 其特征在于， 还包括EAPV 探针， 所述EAPV探针包括四个修饰位点： 距离5 ′端≥35nt的中部位置标记一个dSpacer， THF， 作为核酸外切酶的识别位点； THF位点的上游标记 一个荧光基团， 下游标记 一个淬灭基 团， 两个基团的间距为2 ‑4nt； THF距离 3′末端≥15nt， 并且3 ′末端标记一个修饰 基团。 3.根据权利要求2所述的快速检测东亚西番莲病 毒的试剂 盒， 其特征在于， 所述修饰基 团选自胺基、 磷酸基团或C 3‑Spacer。 4.根据权利要求2或3所述的快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒， 其特征在于， 所述 EAPV探针的序列为： tgctaatccatatgtaccgtatgcgtca[FAM ‑dT]t[THF][BHQ1 ‑dT]gagaagggtataca[C3 ‑ spacer]。 5.快速检测东 亚西番莲病毒的方法， 包括： 1)向反应管中加入上游引物、 下游引物、 探针、 RNase ‑free水、 核酸模板和缓冲液； 上游引物的序列为： 5 ′ ‑gattcaaatcttggaagatgacccatatatc c‑3′， 下游引物的序列为： 5 ′ ‑gtatgagtgtgattgtgatgggcaatccac‑3′， 探针序列为： tgctaatccatatgtaccgtatgcgtca[FAM ‑dT]t[THF][BHQ1 ‑dT]gagaagggtataca[C3 ‑ spacer]； 2)混匀后， 将反应液甩至管子底部， 然后立即将反应管放入恒温设备中， 恒温42℃， 反 应时间30min； 3)将反应后的产物置于荧光检测仪中， 在阴性对照呈现无荧光， 阳性对照呈现荧光的 情况下， 若样 品呈现荧光， 说明此样品存在EAPV病毒的感染； 若样品无荧光， 说明此样品不 存在EAPV病毒的感染。 6.根据权利要求5所述的快速检测东亚西番莲病 毒的方法， 其特征在于， 步骤1)中通过 以下方法获取核酸模板： 取5 ‑10g百香果新鲜的嫩叶置于1.5mL的离心管中， 加入15 ‑25μL  RNase free水， 用研磨棒将其研磨至匀浆状， 吸取2 μL至新的离心管中并稀释 至50 μL作为核 酸模板使用。 7.根据权利 要求5所述的快速检测东亚西番莲病毒的方法， 其特征在于， 步骤1)每10 μL 反应体系中， 加入0.4 μL上游引物、 0.4 μL下游引物、 0.24 μL探针、 2.08 μL  RNase‑free水、 0.5 μL核酸模板和6.38 μL缓冲液。 8.根据权利要求5所述的快速检测东亚西番莲病 毒的方法， 其特征在于， 步骤1)中引物 和探针浓度分别为10 μM和5 μM 。 9.根据权利要求5 ‑7任意一项所述的快速检测东亚西番莲病毒的方法， 其特征在于， 步 骤3)中阴性对照的模板为RNase ‑free水， 阳性对照的模板为EAPV质粒。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114934133 A 2快速检测东亚 西番莲病毒 的试剂盒及方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 植物病毒检测技术领域， 具体涉及快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒 及方法。 背景技术 [0002]东亚西番莲病毒(East  Asian passiflora  virus， EAPV)是马铃薯Y病毒属 (Potyvirus)病毒中的一种， 是百香果(Passiflora  edulis)上危害较严重的一类病毒。 EAPV病毒病发生后， 百香果会表现为花叶、 斑驳和皱缩， 会通过介体传播及非介体传播在种 苗间快速扩散感染， 感染率在30％～40％， 严重的90％以上， 并且一旦感染， 治愈率几乎为 0。 最佳防御措施是高温销毁 以阻断传播。 目前EAPV已在中国、 日本等亚洲国家和地区陆续 发生， 对百香 果产量和品质造成了不同程度的影响。 [0003]自2018年开始， 百香果被列为海南特色农产品调优增效产业之一， 目前全省种植 面积为1.3万亩左右， 反季节销售使 百香果已成为促进当地农业经济增长的重要产业。 但海 南省百香果种植目前尚无自主培育的优良新品种， 近年来大规模引种栽培百香果易忽视病 毒病防控工作。 同时海南百香果销售很大部分是以个体农户或小规模的生产经营为主， 种 植技术水平较低， 田间管理较粗放， 病毒病介体传播及非介体传播防治还不到位。 所以病毒 病成为了威胁百香果产业 发展的一个重要技术障碍， 与此同时大规模的对 百香果实现田间 病毒病快速检测， 从源头阻断传播、 降低田间感染率成为百香 果病毒病防控的重中之重 。 发明内容 [0004]针对上述问题， 本发明提供了快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒及方法， 可以在 田间实现短时、 准确的批量检测EAPV病毒。 [0005]为了实现本发明的技 术目的， 本发明采用的技 术方案为： [0006]本发明提供了快速检测东亚西番莲病毒的试剂盒， 包括： EAPV引物， 所述EAPV引物 的序列为： [0007]EAPV‑F： 5′ ‑gattcaaatcttggaagatgacccatatatc c‑3′， [0008]EAPV‑R： 5′ ‑gtatgagtgtgattgtgatgggcaatccac‑3′。 [0009]优选地， 还包括EAPV探针， 所述EAPV探针包括四个修饰位点： 距离5 ′端≥35nt的中 部位置标记一个dSpacer(四氢呋喃， THF)， 作为核酸外切酶 的识别位点； THF位点的上游标 记一个荧光基团， 下游标记一个淬灭基团， 两个基团的间距为2 ‑4nt； THF距离3 ′末端≥ 15nt， 并且3 ′末端标记一个修饰 基团。 [0010]更优选地， 所述 修饰基团选自胺基、 磷酸基团或C 3‑Spacer。 [0011]更优选地， 所述EAPV探针的序列为： [0012]tgctaatccatatgtaccgtatgcgt ca[FAM‑dT]t[THF][BHQ1‑dT]gagaagggtataca[C3 ‑ spacer]。 [0013]本发明还提供了快速检测东 亚西番莲病毒的方法， 包括：说　明　书 1/4 页 3 CN 114934133 A 3