(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210128468.3 (22)申请日 2022.03.29 (71)申请人 复旦大学附属妇产科医院 地址 200011 上海市黄浦区方斜路419号 申请人 厦门飞朔生物技 术有限公司 (72)发明人 陈婷婷　刘天齐　陈志宏　陈琰　 周先荣　 (74)专利代理 机构 北京鑫瑞森知识产权代理有 限公司 1 1961 专利代理师 王立普 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C40B 50/06(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于高通量测序子宫内膜癌分子分型 的文库构建方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于高通量测序子宫内 膜癌分子分型的文库 构建方法， 属于生物技术领 域。 本发明基于多重PCR的扩增子靶向高通量测 序， 同时对11个基因突变和10个微卫星 位点检测 微卫星不稳定状态进行检测， 根据检测结果评估 内膜癌患者分子特征。 本发明最低能稳定检出 5ng/μL样本中2％突变比例和肿瘤含 量为5％的 微卫星不稳定状态， 分型结果准确性更高； 本发 明检测的基因数目更多， 可获得更多的肿瘤突变 信息； 本发明文库构建过程仅需3～5小时， 操作 简便、 成本低廉； 本发明仅通过一次检测即可完 成子宫内膜癌的分子分型。 本发 明更适合临床应 用， 能更好地辅助医生评估患者预后、 调整临床 治疗方案， 还能满足遗传性子宫内膜癌的筛查 等。 权利要求书2页 说明书41页 序列表125页 附图4页 CN 114438210 A 2022.05.06 CN 114438210 A 1.一种基于高通量测序的子宫内膜癌分子分型的引物， 其特征在于， 包括特异修饰性 扩增引物和接头扩增引物， 所述特异修饰性扩增引物的序列如SEQ  ID NO.1～SEQ  ID  NO.788所示， 所述接 头扩增引物的序列如SEQ  ID NO.789～SEQ ID NO.790所示。 2.一种基于高通量测序的子宫内膜癌分子分型的试剂盒， 其特征在于， 包含如权利要 求1所述的引物。 3.一种基于高通量测序子宫内膜癌分子分型的文库构建方法， 其特征在于， 包括如下 步骤： (1)使用所述特异修饰性扩增引物对待测样本进行超多重PCR富 集反应； (2)富集产物纯化； (3)接头连接所述接 头扩增引物进行PCR反应获得文库； (4)文库的纯化。 4.根据权利要求3所述的文库构建方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中的待测样本为手 术切除的新鲜病理组织， 甲醛固定石蜡包埋病例组织， 石蜡切片， 全血， 血浆， 血清， 胸腔积 液中的一种。 5.根据权利 要求3所述的文库构建方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中的PCR扩增程序如 下表所示： 6.根据权利 要求3所述的文库构建方法， 其特征在于， 所述步骤(1)中的PCR扩增反应体 系包括EC‑1体系和E C‑2体系； 所述EC‑1体系如下表所示： 所述EC‑2体系如下表所示：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114438210 A 27.根据权利 要求3所述的文库构建方法， 其特征在于， 所述步骤(3)中PCR扩增程序如下 表所示： 8.根据权利 要求3所述的文库构建方法， 其特征在于， 所述步骤(3)中PCR扩增反应体系 如下表所示： 序号 物料 物料浓度 用量( μL) 1 RingCapbuf fer 10× 2.5 2 MgCl225mM 4 3 dNTPs 10 μM 1 4 Ill‑iXX‑P7(SEQ ID NO.790) 50 μM 0.2 5 Ill‑iXX‑P5(SEQ ID NO.789) 50 μM 0.2 6 H2O 纯化水 11.85 7 RingCap‑Taq酶 5U/ul 0.25 8 富集PCR纯化产物 ‑ 5 总体积 25 9.根据权利要求3 ‑8中任一项所述的文库构建方法， 其特征在于， 所述文库构建方法实 现的是对11个基因MSH2、 PMS2、 MLH1、 MSH6、 EPCAM、 POLE、 TP53、 PTEN、 PIK3CA、 KRAS和CTNNB1 突变和对10个微 卫星位点检测微 卫星不稳定状态的检测。 10.根据权利要求3 ‑9中任一项所述的文库构建方法所构建的测序文库。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114438210 A 3