(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210325615.6 (22)申请日 2022.03.29 (71)申请人 中南民族大 学 地址 430074 湖北省武汉市洪山区民族大 道708号 (72)发明人 王毅　贾国帅　徐筱萌　 (74)专利代理 机构 武汉华旭知识产权事务所 42214 专利代理师 高剑锋 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6865(2018.01) C12Q 1/6825(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种基于G4-ThT生物传感器和NASB A的猪瘟 病毒检测方法及其试剂盒 (57)摘要 本发明属于基因工程技术领域， 特别是一种 基于G4‑ThT生物传感器和NASB A的猪瘟病毒检测 方法及其试剂盒， 具体方法包括以从猪瘟病毒样 品中提取的病毒RNA为扩增对象、 采用等温核酸 扩增技术进行等温扩增、 然后加入含有Tri s‑HCl 和KCl的缓冲液， 再加硫黄 素T促进扩增产物上的 G‑四链体折叠并形成 复合物、 在特定波长的光源 激发条件下检测荧光并根据其强弱进行判断。 本 发明提供了一种不需要特殊的生物素标记或巯 基修饰处理的探针、 检测成本明显降低的检测方 法及试剂盒。 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 114875176 A 2022.08.09 CN 114875176 A 1.一种基于G4 ‑ThT生物传感器和NASBA的猪瘟病毒检测方法， 其特征在于： 以从猪瘟病 毒样品中提取的病毒RNA 为扩增对象， 采用等温核酸扩增技术， 利用逆转录酶AMV、 核糖核酸 酶H及T7RNA聚合酶进行等温扩增， 产生大量单链RNA扩增产物； 然后加入含有Tris ‑HCl和 KCl的缓冲液， 再加硫黄素T促进扩增产物上的G ‑四链体折叠并形成复合物， 再对扩增产物 以425nm波长的光源激发并检测490nm波长处发射的荧 光， 根据荧 光的强弱进行判断。 2.根据权利要求1所述的一种基于G4 ‑ThT生物传感器和NASBA的猪瘟病毒检测方法， 其 特征在于， 具体步骤为： 步骤1.NASBA扩增： 将纯化好的的猪瘟病毒RNA样品加入到NASBA反应缓冲液体系， 体系 中包含50mM  Tris/HCl  pH8.5， 10mM  MgCl2， 90mM KCl， 10mM  DTT， 每种dNTP  1mM， 每种NTP   2mM， 10％(v/v)DMSO， 0.4 μM  NASBA正向引物和0.4 μMNASB A反向引物， 反应步骤为加入2 μL靶 RNA， 混合物在65℃温育5分钟以解开靶RNA的二级结构， 然后将反应 混合物转移至41℃退火 5min， 再向管中加入5.6 μL酶混合物， 所述酶混合物包含4mM  DTT， 2 μg BSA， 30U T7RNA聚合 酶， 6U AMV‑Rt， 0.1URNase  H， 得到终体积为2 5 μL， 将混合物进一步在41℃温育2小时以进行 靶RNA的等温扩增； 所述正向引物为E2F ‑GG29： CCCCTACCTCCCGCCCCTACCCGTCCCCC ‑ CACCACCTGGAAAGAA； 所述反向引物为E2R ‑T7： AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCTCCTAC TGACCA； 步骤2.G‑四链体荧光检测反应： 取G ‑四链体扩增产物荧光检测反应缓冲液， 反应缓冲 液的组成包括50mM的Tris ‑HCl， pH7.0和50mM的氯化钾， 加无菌双蒸水补足为72μl， 加入 NASBA反应后溶液25 μL， 然后85℃变性3min后降至室温； 加入100 μM硫黄 素T溶液3 μL， 然后将 溶液转移到96孔酶标板中， 将酶标板放入酶标仪或荧光光度计， 以425nm波长的光源激发， 检测490nm波长处发射的荧光， 检测到的荧光强度高于1.0 ×106RFU即判断为猪瘟病毒阳 性。 3.一种基于G4 ‑ThT生物传感器和NASBA的猪瘟病毒检测试剂盒， 其特征在于包括以下 物质： (1)NASBA反应缓冲液包括： 50mM  Tris/HCl pH8.5， 10mM  MgCl2， 90mM KCl， 10mM  DTT， 每 种dNTP 1mM， 每种NTP  2mM， 10％(v/v)DMSO； (2) N A S B A 正向 引物 和反向 引物 ， 包 括 ： 0 .4μM 正向 引物 E 2 F ‑G G 2 9 ： CCCCTACCTCCCGCCCCTACCCGTCCCCC ‑CACCACCTGGAAA GAA； 0.4 μM反向引物E2R ‑T7： AATTCTAAT ACGACTCACTATAGGGAGATACCTCCTACTGACCA； 其中正向引物前端包含G ‑四链体序列GG29的反 向互补序列CCCCTA CCTCCCGCCCCTA CCCGTCCCCC和CSFV ‑E2结合序列CA CCACCTGGAAAGAA， 反向 引物前端则加上带有保护碱基的T7启动子序列AATTCTAATA CGACTCACTATAGGGAGA和CSFV ‑E2 结合序列TAC CTCCTACTGAC CA； (3)NASBA酶反应液， 包括： 4mM  DTT， 2 μg BSA， 30U T7RNA聚合酶， 6UAMV ‑Rt， 0.1U RNase  H； (4)G‑四链体扩增产物检测反应缓冲液， 包括： 50mM的Tris ‑HCl pH7.0和50mM的氯化 钾； 硫黄素T  3 μM。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114875176 A 2一种基于G4 ‑ThT生物传感器和NASBA的猪瘟病毒检测方 法及 其试剂盒 技术领域 [0001]本发明属于基因工程技术领域， 特别是一种基于G4 ‑ThT生物传感器和 NASBA的猪 瘟病毒检测方法及其试剂盒。 背景技术 [0002]中国发明专利 《CN104611462A ‑一种基于G ‑四链体荧光特性的猪瘟病毒检测方法 及试剂盒》 中公开了有关于基于G ‑四链体荧光特性检测 猪瘟病毒的相关方法， 但该方法在 G‑四链体荧 光检测反应缓冲液中 需要使用到昂贵的荧 光基团标记的探针， 成本较高。 发明内容 [0003]为了解决上述问题， 本发明提供了一种不需要特殊的生物素标记或巯基修饰处理 的探针、 检测成本明显降低的检测方法及试剂盒， 采用的技 术方案如下： [0004]一种基于G4 ‑ThT生物传感器和 NASBA的猪瘟病毒检测方法， 以从猪瘟病毒样品中 提取的病毒RNA为扩增对象， 采用等温核酸扩增技术， 利用逆转录酶AMV、 核糖核酸酶H及 T7RNA聚合 酶进行等 温扩增， 产生大量单链RNA扩增产物； 然后加入含有Tris ‑HCl和KCl的缓 冲液， 再加硫黄素T促进扩增产物上的G ‑四链体折叠并形成复合物， 再对扩增产物以425nm 波长的光源激发并检测490nm波长处发射的荧 光， 根据荧 光的强弱进行判断。 [0005]所述方法的具体步骤为： [0006]步骤1.NASBA扩增： 将纯化好的的猪瘟病毒RNA样品加入到NASBA反应缓冲液体系， 体系中包含50mM  Tris/HCl  pH8.5， 10mM  MgCl2， 90mM KCl， 10mM  DTT， 每种dNTP  1mM， 每种 NTP 2mM， 10％(v/v)DMSO， 0.4 μM  NASBA正向引物和0.4 μM  NASBA反向引物， 反应步骤为加入 2 μL靶RNA， 混合物在65℃ 温育5分钟以解开靶RNA的二级结构， 然后将反应混合物转移至41 ℃退火5min， 再向管中加入5.6μL酶混合物， 所述酶混合物包含4mM  DTT， 2μg BSA， 30U  T7RNA聚合酶， 6U  AMV‑Rt， 0.1U RNase H， 得到终体积为2 5 μL， 将混合物进 一步在41℃温育2 小时以进行靶RNA的等温扩增； 所述 正向引物为E2F ‑GG29： CCCCTACCTCCCGCCCCTACCCGTCCCCC ‑CACCACCTGGAAAGAA； 所述反向引物为E2R ‑T7： AATTCTAA TACGACTCACTATAG GGAGATACCTCCTACTGAC CA； [0007]步骤2.G‑四链体荧光检测反应： 取G ‑四链体扩增产物荧光检测反应缓冲液， 反应 缓冲液的组成包括50mM的Tris ‑HCl， pH7.0和50mM的氯化钾， 加无菌双蒸水补足为72 μl， 加 入NASBA反应后溶液2 5 μL， 然后85℃变性3min后降至室温； 加入100 μM硫黄素T溶液3 μL， 然后 将溶液转移到96孔酶标板中， 将酶标板放入酶标仪或荧光光度计， 以425nm波长的光源激 发， 检测490nm波长处发射的荧光， 检测到的荧光强度高于1.0 ×106RFU即判断为猪瘟病毒 阳性。 [0008]一种基于G4 ‑ThT生物传感器和NASBA的猪瘟病毒检测试剂盒， 包括以下物质： [0009](1)NASBA反应缓冲液包括： 50mM  Tris/HCl  pH8.5， 10mM  MgCl2， 90mM KCl， 10mM  说　明　书 1/3 页 3 CN 114875176 A 3