(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210330187.6 (22)申请日 2022.03.28 (71)申请人 中国人民解 放军陆军 军医大学第二 附属医院 地址 400037 重庆市沙坪坝区新 桥正街83 号 (72)发明人 赵景宏　黄英辉　张均　熊加川　 章波　 (74)专利代理 机构 北京同恒源知识产权代理有 限公司 1 1275 专利代理师 廖曦 (51)Int.Cl. C12N 15/12(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6883(2018.01)C12Q 1/6869(2018.01) (54)发明名称 一种Alport综合征患者COL4A5致病突变基 因及其检测试剂 (57)摘要 本发明提供一种Alport综合征患者COL4A5 致病突变基因及其检测试剂， 所述突变位于 COL4A5基因第七号内含子区域， 第439 ‑7位核酸 序列由腺嘌呤突变为鸟嘌呤， 即COL4A5,c.439 ‑7 (IVS7)A>G。 此突变可引起COL4A5基因的mRNA剪 接异常， 导致移码突变。 该移码突变导致COL4A5 基因所编码蛋白质发生结构改变。 本发明的检测 试剂可有效、 快速地检测COL4A5的上述致病突 变， 且价格低廉。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图3页 CN 114480411 A 2022.05.13 CN 114480411 A 1.一种Alport综合征患者COL4A5致病突变基因， 其特征在于， 所述突变位于COL4A5基 因第七号内含子区域， 第439 ‑7位核酸序列由腺嘌呤突变为鸟嘌呤， 即c.439 ‑7(IVS7)A>G； 此突变可引起COL 4A5基因的mRNA剪 接异常， 导 致改变编码蛋白质结构的移码突变。 2.根据权利要求1所述的Alport综合征患者COL4A5致病突变基因， 其特征在于， 所述 mRNA剪接异常是指mRNA  RT‑PCR产物第439 ‑7位多余6个碱基TA ATAG。 3.根据权利 要求1所述COL4A5致病突变基因的病因学诊断试剂， 其特征在于， 所述诊断 试剂包括基因组DNA点突变分析试剂， 所述分析试剂包括1)患者样本基因组DNA提取试剂 盒； 2)DNA ‑PCR扩增试剂盒： 采用引物P1和P2扩增患者基因组DNA， 获得目的条带； 3)DNA ‑PCR 产物Sanger测序试剂盒： 以引物P2对DNA ‑PCR产物Sanger测序； 当检测得到COL4A5基因第七 号内含子区域， 第439 ‑7位核酸序列由腺嘌呤突变为鸟嘌呤， 即c.439 ‑7(IVS7)A>G， 确诊为 Alport综合征患者。 4.根据权利 要求3所述COL4A5致病突变基因的病因学诊断试剂， 其特征在于， 所述用于 患者基因 组DNA提取的样本为： 外周血、 尿液、 或指甲。 5.根据权利 要求2所述COL4A5致病突变基因的病因学诊断试剂， 其特征在于， 所述诊断 试剂包括mRNA突变分析试剂， 所述试剂包括1)患者样本RNA提取试剂盒； 2))RT ‑PCR扩增试 剂盒： 以引物P3和P4扩增患者RNA， 获得目的条带； 3)RT ‑PCR产物Sanger测序试剂盒： 以引物 P3对RT‑PCR产物Sanger测序； 当检测得到mRNA第439 ‑7位多余6个碱基TAATAG时， 确诊为 Alport综合征患者。 6.根据权利 要求5所述COL4A5致病突变基因的病因学诊断试剂， 其特征在于， 所述用于 患者RNA提取的样本为： 尿液或血 液。 7.根据权利 要求3所述病因学诊断试剂中用于扩增患者基因组DNA的引物对组P1和P2， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.1‑2所示。 8.根据权利 要求3所述病因学诊断试剂中用于基因组DNA ‑PCR产物Sanger测序的引物， 其核苷酸序列如SEQ  ID NO.2所示。 9.根据权利 要求5所述病因学诊断试剂中用于扩增患者RNA的引物对组P3和P4， 其核苷 酸序列如SEQ  ID NO.3‑4所示。 10.根据权利要求5所述病因学诊断试剂中用于RT ‑PCR产物Sanger测序的引物， 其核苷 酸序列如SEQ  ID NO.3所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114480411 A 2一种Alport综合征患者COL4 A5致病突变基因及其检测试剂 技术领域 [0001]本发明涉及 遗传病基因检测领域， 具体涉及一种Alport综合征患者COL4A5致病突 变基因及其检测试剂。 背景技术 [0002]Alport综合征(A lport syndrome,AS)是一种常见的遗传性肾炎综合征， 主要表现 为血尿、 肾功能进 行性减退、 感音神经性耳聋和眼部异常。 该病是由于编 码肾小球基底膜的 主要胶原成分 ‑IV胶原基因突变而产生的肾小球基底膜疾病。 IV型胶原6条 ɑ链聚合成3条三 股螺旋分子结构称为单体， 单体聚合形成二聚体或四聚体， 再相互绞连形成胶原网状结构 。 电镜下可观察到Alport综合征特征性的病理改变， 肾小球基底膜(Glomerular  Basement   Membrane， GBM)广泛增厚、 或变薄以及致密层分裂为其典型病 变。 GBM致密层不规则的外观 是超微结构最突出的异常， 其范围既可累及所有的毛细血管襻或毛细血管襻内所有的区 域， 也可累及部 分毛细血管襻或毛细血管襻内的部 分区域。 因此， 临床常用肾活检术从病理 上加以诊断， 但这是一种有创检查， 患者可能因此而 出现并发症。 不能为上述患者提供准确 的治疗指导。 [0003]近年来， AS的致病基因已经被鉴定出来， 使得肾病综合征的基因诊断成为可能。 这 些致病基因包括COL4A5、 COL4A6、 COL4A3和COL4A4， 其筛查可以帮助临床医师完成AS的 “基 因诊断”。 这不仅可避免临床盲目用药及由此带来的药物不良反应和经济负 担， 对某些患者 还可能进行早期干预或治疗， 延迟甚至避免终末期肾脏病(End  stage renal disease， ESRD)的发生。 [0004]既往的研究显示： 基因突变多位于全外显子区域， 表 现为某种氨基酸编码的突变。 目前， 对AS患者的致病基因的检测， 多采用全外显子测序技术。 如中国专利申请 CN104450726A公开的COL 4A5基因突变 体及其应用。 [0005]然而， 最近报道在基因内含子区域同样也可以存在某些突变而导致mRNA剪接改 变。 这些突变需要在mRNA水平对编 码基因产生的效应进 行证明。 因此， 鉴定内含子区域的致 病突变， 并研发省时、 精准的对实验 条件要求较低的诊断试剂对AS患者进 行快速检测， 对AS 临床基因诊断具有必要性。 [0006]目前， 对于AS患者基因内含子区域突变导致mRNA剪接改变而致病的报道相对较 少。 发明内容 [0007]有鉴于此， 为了克服现有技术 的不足， 本发明提供一种可导致mRNA剪接异常的AS 致病基因突变， 并基于此研发了突变检测试剂 。 该突变检测试剂可以快速、 准确判断检测对 象是否具有此致病突变。 [0008]本发明提供一种Alport综合征患者COL4A5致病突变基因， 所述突变位于COL4A5基 因第七号内含子区域， 第439 ‑7位核酸序列由腺嘌呤突变为鸟嘌呤， 即c.439 ‑7(IVS7)A>G；说　明　书 1/7 页 3 CN 114480411 A 3