(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210312597.8 (22)申请日 2022.03.28 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114606230 A (43)申请公布日 2022.06.10 (73)专利权人 广东省农业科 学院动物卫 生研究 所 地址 510640 广东省广州市天河区五山路 白石岗 专利权人 江门市动物疫病预防控制中心 (72)发明人 董嘉文　李林林　陈修邓　张俊勤　 廖明　陆巧芬　孙敏华　曹建伟　 黄允真　沈书文　吴晓斌　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 专利代理师 薛建强 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01)C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) (56)对比文件 CN 113355460 A,2021.09.07 CN 113355460 A,2021.09.07 CN 103966359 A,2014.08.0 6 Yunzhen Huang等.Iso lation and characterizati on of a new go ose orthoreovirus causi ng liver and sple en focal necrosis i n geese, China. 《Transboundary and Emergi ng Diseases》 .2021,第1-7页. NCBI.GenBan k登录号： JX478262.1. 《NCBI GenBank》 .2020,第1- 3907位. NCBI.GenBan k登录号： JX145 330.1. 《NCBI GenBank》 .2012,第1- 3907位. 审查员 胡百灵 (54)发明名称 一种用于鉴定新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅 呼肠孤病毒的检测试剂盒及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于鉴定新型鸭呼肠孤 病毒和新型鹅呼肠孤病毒的检测试剂盒及其应 用， 该试剂盒基于SEQ  ID NO:3所示的探针和SEQ   ID NO:1～2所示的引物对构成。 基于 该检测试剂 盒的检测方法检测速度快且高通量， 对于新型鸭 呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒具有较好的特 异性， 对于新型鸭呼肠孤病毒的最低检测限可达 到17.8copies， 对于新型鹅呼肠孤病毒的最低检 测限可达到35.3copies。 该检测方法对于新型鸭 呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的监测和防控 具有极为重要的意 义。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图3页 CN 114606230 B 2022.11.29 CN 114606230 B 1.一种用于鉴别新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的检测试剂， 其特征在于， 所 述检测试剂中含引物和探针； 所述引物同时靶向扩增出新型鸭呼肠孤病毒和新型 鹅呼肠孤病毒； 所述引物为： 引物F： 5' ‑CAGACATATGATGAC CTC‑3'； 引物R： 5' ‑CAACGTAMCCATTTAGTG‑3'； 所述探针靶向新型鸭 呼肠孤病 毒和新型鹅呼肠孤病 毒中的一段基因序列， 在所述基因 序列中， 新型鸭呼肠孤病毒和新型 鹅呼肠孤病毒存在一个T15 C的多态性 位点； 所述探针为： 探针P： 5' ‑TTAACTGTCAAGCCTTGGCGA‑3'。 2.权利要求1所述的检测试剂在制备用于鉴别新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病 毒 的检测试剂盒中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特 征在于， 所述检测试剂盒的使用方法为： (1)使用权利要求1中所述的检测试剂扩增检测样品； (2)对扩增产物进行 熔解曲线分析， 确定样品中的病毒类型； 其中， 所述病毒类型的判定标准 为： 若检测样品的熔解温度与新型鸭呼肠孤病毒阳性对照的ΔTm值的绝对值小于0.26℃ 时， 则判定为 新型鸭呼肠孤病毒； 若检测样品的熔解温度与新型鹅呼肠孤病毒阳性对照的ΔTm值的绝对值小于0.34℃， 则判定为 新型鹅呼肠孤病毒； 若未出现扩增， 则其即不是新型鸭呼肠孤病毒也 不是新型 鹅呼肠孤病毒。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特 征在于， 步骤(1)中所述扩增的体系为： 5.根据权利 要求3所述的应用， 其特征在于， 步骤(1)中所述扩增的反应程序为： 50℃反 转录30min， 94～95℃ 预变性2～5min； 94～95℃变性18～20s， 50℃退火15～18s， 72℃延伸 15～18s， 循环45～5 0次。 6.根据权利 要求3所述的应用， 其特征在于， 步骤(2)中所述熔解曲线分析程序为： 95℃ 变性10s， 37℃退火60s， 37℃到97℃以0.2℃/s的速率， 5次/℃连续采集探针荧光信号， 进行 熔解曲线分析。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114606230 B 2一种用于鉴定新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒 的检测 试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及病毒检测领域， 具体涉及一种用于鉴定新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼 肠孤病毒的检测试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]新型鸭呼肠孤病毒病由新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)引起， 其发病表现为软脚， 肝脾 等脏器上出现斑块状出血和坏死， 肾脏肿大、 出血、 表面有黄白色条斑。 新型鸭呼肠孤病毒 病是一种高发病率、 高致死率的急性、 烈性、 病毒性传染病。 该病除麻鸭易 感性略差以外， 其 它品种鸭均可发病。 [0003]新型鹅呼肠孤病毒(NGRV)是2020年由发明人课题组首次在发病鹅上分离鉴定得 到的， 该病毒引起以肝、 脾等器官出现点状白色灶性坏死为主要病变特征的传染性疾病。 经 过序列和系统发育分析可知， 新型鹅呼肠 孤病毒(NGRV)与番鸭呼肠 孤病毒(MDRV)的全基因 氨基酸序列的同源性高达90％， NGRV病毒株与其它水禽源呼肠孤病毒 聚集在同一分支上， NGRV可能是由不同的水禽源呼肠 孤病毒重组产生， 但该病毒仍然属于呼肠孤病毒 科正呼肠 孤病毒属(Huang  Y,Zhang J,Dong J,et al.Isolation  and characterization  of a new  goose orthoreovirus  causing liver and spleen focal necrosis  in geese,China [J].Transboundary  and Emerging Diseases,2021.)。 [0004]由于水禽源呼肠孤病毒存在重组的可能性， 新型鹅呼肠孤病毒可能是由新型鸭呼 肠孤病毒和番鸭呼肠孤病毒重组而来， 因此， 尽管新型鹅呼肠孤病毒当下只感染鹅， 但不排 除该病毒会跨越品种传播到鸭子或其他水禽上。 而且新型鹅呼肠孤病毒检测的手段尚未完 善， 缺乏对其有效的监控。 因此， 建立一种能够有效鉴别新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤 病毒的检测方法具有非常重要的现实意 义。 [0005]目前已报道的用于检测水禽源呼肠孤病毒病原的方法主要有： 病毒分离鉴定、 琼 脂扩散试验、 普通PCR以及荧光定量PCR等， 但目前并未有 能够有效针对新型鸭呼肠孤病毒 和新型鹅呼肠孤病毒的快速检测 和鉴别方法。 发明内容 [0006]本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。 为此， 本发明提出一 种用于鉴定新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒的检测试剂盒及其应用， 该检测方法仅 基于一对检测引物对和一条探针即可准确的区分新型鸭呼肠孤病毒和新型鹅呼肠孤病毒， 其相比与测序等常规方法的检测分型成本低， 应用价值更广阔， 对新型鸭呼肠孤病毒病和 新型鹅呼肠孤病毒病的监测 和流行病学调查 等方面具有重要意 义。 [0007]本发明的第一个方面， 提供一组引 物对， 该引 物对同时靶向扩增出新型鸭呼肠孤 病毒和新型 鹅呼肠孤病毒。 [0008]在本发明中， 发明人设计得到的引物对可同时靶向扩增出新型鸭呼肠孤病毒和新说　明　书 1/8 页 3 CN 114606230 B 3