(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210312962.5 (22)申请日 2022.03.28 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 丁芳　霍妍妍　李晓婷　洪霓　 王国平　 (74)专利代理 机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42231 专利代理师 姜婷 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 一种百合病毒 LCrV-1特异性检测靶序列、 试 剂盒及检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种百合病毒LCrV1特异检测 靶序列、 试剂盒及检测方法， 所述靶序列的碱基 序列如SEQ  ID NO:1所示， 所述检测试剂盒包括 碱基序列如SEQ  ID NO:2和SEQ  ID NO:3所示的 引物对， 所述检测方法为： 将待测样品用改进的 Trizol法对RNA进行提取， 逆 转录得到cDNA， 使用 引物对进行PCR扩增后采用凝胶电泳分析。 本发 明能够实现百合病毒 LCrV1的快速、 特异性检测， 能够广泛用于田间采集的百合样品检测。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 CN 114717359 A 2022.07.08 CN 114717359 A 1.一种百合病毒LCrV1特异性检测靶序列， 其特征在于， 所述靶序列的碱基序列如SEQ   ID NO:1所示。 2.一种针对权利要求1所述靶序列的百合病毒LCrV1特异性检测试剂盒， 其特征在于， 包括碱基序列如SEQ  ID NO:2和SEQ  ID NO:3所示的引物对。 3.一种百合病毒LCr V1的检测方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1、 提取百合样品的总RNA； S2、 取总RNA通过逆转录酶合成cDNA； S3、 以cDNA为模板， 使用权利 要求2所述引物对进行PCR扩增， 产物进行琼脂糖凝胶电泳 检测。 4.根据权利 要求3所述百合病毒LCrV 1的检测方法， 其特征在于， 步骤S1具体为： 将百合 叶片研磨后与Tr izol混匀， 离心取上清， 加入氯仿抽提； 离心取上清， 加入异丙醇混匀， 沉降 后离心弃 上清； 采用乙醇洗涤沉淀， 再在沉淀中加入DEPC水使沉淀溶解， 即为样品总RNA。 5.根据权利 要求3所述百合病毒LCrV 1的检测方法， 其特征在于， 步骤S2具体为： 取步骤 S1制备的总RNA， 加 入随机引物pd(N)6和DEPC水， 先沸水浴再迅速冷却后， 加 入反转录混合 液， 吸打混匀、 瞬离； 37℃水浴1～1.5 h后， 先沸水浴再迅速冷却， 瞬离即得。 6.根据权利要求5所述百合病毒LCrV1的检测方法， 其特征在于， 所述反转录混合液包 括： 4μL5×M‑MLV反应缓冲液、 1μL2.5mM  dNTPs、 0.5μL40U/μLRNA酶抑制剂、 0.5μL200U/μL   M‑MLV和4 μLDEPC水， 按总体积10 μL计。 7.根据权利要求3所述百合病毒LCrV 1的检测方法， 其特征在于， 步骤S3所述PCR扩增的 体系为： 共20 μL， 10.0 μL  2×Taq Master Mix， 0.3 μM引物对， 1.0 μL  cDNA， ddH2O余量。 8.根据权利要求3所述百合病毒LCrV 1的检测方法， 其特征在于， 步骤S3所述PCR扩增的 程序为： 95℃预变性5min； 95℃变性30s， 52℃退火， 72℃延伸25s， 30个循环； 72℃完全延伸 10min。 9.根据权利 要求3所述百合病毒LCrV 1的检测方法， 其特征在于， 所述产物在1.2％琼脂 糖凝胶电泳上进行电泳检测， 其中阳性样品能扩增出 大小约80 0bp的目的片段。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114717359 A 2一种百合病毒LCrV‑1特异性检测靶序列、 试剂盒及检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物检测技术领域， 具体涉及一种百合病毒LCrV ‑1特异检测靶序列、 试剂盒及检测方法。 背景技术 [0002]百合鳞茎色泽洁白， 肉质肥厚， 不仅是高蛋白低脂肪的营养保健食品， 还具有止咳 润肺的药用功 能。 近年来培育出 的百合品种逐渐增多， 但是百合病毒是其生产中的重要限 制因子。 已报道的百合病毒大部分是通过指示植物法、 电镜观察法和血清学技术等鉴定出 来的， 但通常受限于费时、 病毒粒子提取困难等很难高效、 全面的发现潜在的病毒或新病 毒。 高通量技术(Hight ‑throughput  sequencing，  HTS)可同时对几十万到几百万个DNA分 子进行序列鉴定， 使 得对一个物种的转录组和基因组进 行细致全貌的分析成为可能， HTS被 广泛应用于新病毒的发现、 已知病原鉴定及基因 组遗传多样性和进化的分析与比较。 [0003]国际病毒分类委员会对双分病毒科(Partitiviridae)划分为5个属， 分别为甲型 双分病毒属(Alphapartitivirus)、 乙型双分病毒属(Betapartitivinus)、 丙型双分病毒属 (Gammapartitivirus)、 丁型双分病毒属(Deltapartitivirus)和隐孢子虫病毒属 (Cryspovirus)。 其中， 丁型双分病毒属(Deltapartitivirus)有五种病毒，  Beet cryptic  virus 2、 Beet cryptic virus 3、 Fig cryptic virus、 Pepper  cryptic virus 1 和 Pepper cryptic virus 2。 [0004]本发明通过高通量测序从百合上鉴定到了一种新病毒Lily  cryptic virus 1  (LCrV1)， 通过系统进化分析和多重比对， 故确认该病毒 是双分病毒科丁型双分病毒属的新 成员。 目前已经报道的植物双分体病毒科 的病毒的病毒粒子尚未获得， 这些病毒主要由种 子传播， 不能通过机械摩擦的方式传播， 但LCrV1的传播途径还需进一步明确 。 而且带毒种 球传播难以通过 组织培养方法获得无毒种球， 加大了防治难度。 故建立成熟的检测技术， 用 于市场上百合样品病毒检出率的调查， 并为后续致病机理和基因功能提供技术支持， 是当 前迫切的需求。 发明内容 [0005]有鉴于此， 本 发明的目的在 于实现该百合新病毒LCrV1的快速、 特异以及低含量的 检测。 [0006]为了实现上述目的， 本发明的技 术方案具体如下： [0007]本发明第一方面提供了一个适合百合病毒LCrV1特异性检测的靶序列， 该靶序列 的碱基序列如SEQ  ID NO:1所示。 [0008]本发明第二方面提供了一个针对上述靶序列的百合病毒LCrV1特异性检测试剂 盒， 该试剂盒中包括碱基序列如SEQ  ID NO:2和SEQ  ID NO:3所示的引物对。 [0009]本发明第三方面 提供了一种百合病毒LCr V1的检测方法， 具体包括以下步骤： [0010]S1、 提取百合样品的总RNA；说　明　书 1/4 页 3 CN 114717359 A 3