(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210314226.3 (22)申请日 2022.03.28 (71)申请人 连云港市第二人民医院(连云港市 临床肿瘤研究所） 地址 222000 江苏省连云港市海州区幸福 路161号 (72)发明人 高绪柱　王彦　王方　黄关宏　 王蕾　 (74)专利代理 机构 无锡苏元专利代理事务所 (普通合伙) 32471 专利代理师 吴忠义 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌的RPA-LFS 检测引物探 针组合及其应用 (57)摘要 本发明公开了荚膜型和非荚膜型流感嗜血 杆菌的RPA ‑LFS检测引物探针组合及其应用； 本 发明的引物探针组合具有很好的特异性， 对其他 的菌株均无交叉扩增， 能检测 1CFU/ul的流感嗜 血杆菌， 并且检测灵敏度不受其他病原菌的干 扰。 本研究与双重PCR检测的结果一致， 分别从 209份样本中检出203份流感嗜血杆菌和63份荚 膜型流感嗜血杆菌， 检出率分别为97.1％和 63.2％。 RPA ‑LFS与双重PCR具有相同的实际应用 性。 本研究成功建立了基于Omp6和BexA基因检测 荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌的RPA ‑LFS检测 方法， 为后续快速检测流感嗜血杆菌提供了方 案， 确保了患者的及时诊断和抗 生素治疗。 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图3页 CN 114574603 A 2022.06.03 CN 114574603 A 1.荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌的RPA ‑LFS检测引物探针组合， 其特征在于， 包括 omp6‑F3/R1B/P引物探针组合和bexA ‑F3/R1B/P引物探针组合； 所述omp6‑F3/R1B/P引物探针组合中 omp6‑F3的序列为： CAG GAAATGGTGCTGCTCA AACTTTTGGCGGTTAC； omp6‑R1B的序列为Bi otin‑ACCAGCTGAGTA ACCTTTAACTAGATCTGCA； omp6‑/P的序列为： FITC‑ACACTGATGA ACGTGATACAC CATAATACAA[THF]ATCGTAT TAGGCCAA‑C3spacer； 所述bexA ‑F3/R1B/P引物探针组合中 引物探针组合中 bexA‑F3的序列为： CAG GAAATGGTGCTGCTCA AACTTTTGGCGGTTAC； bexA‑R1B的序列为： Bi otin‑ACCAGCTGAGTA ACCTTTAACTAGATCTGCA； bexA‑P的序列为： FITC‑CGGTTGAGTATGAT TGTTATGTAATTGATGAG[THF]TGAT TGTAGTAG GG‑C3spacer。 2.权利要求1所述的引物探针组合在荚膜型和 非荚膜型流感嗜血杆菌的RPA ‑LFS检测 引物探针组合检测中或检测试剂盒的制备中的应用。 3.如权利要求1所述的应用， 其特征在于， 采用omp6 ‑F3/R1B/P检测出非荚膜型流感嗜 血杆菌， 采用bexA ‑F3/R1B/P荚膜型流感嗜血 杆菌。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574603 A 2荚膜型和非荚膜型流感嗜血杆菌的R PA‑LFS检测引物探针组 合及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及荚膜型和非荚膜型流感 嗜血杆菌的RPA ‑LFS检测引物探针组合及其应 用。 背景技术 [0002]流感嗜血杆菌(Haemophilus  influenzae， H.influenzae)是一类革兰氏阴性菌， 。 流感嗜血杆菌可以分为荚膜型和非荚膜型， 荚膜型流感嗜血杆菌按血清学实验结果可分为 6种， 分别为a型、 b型、 c型、 d型、 e型和f型。 研究发现， 不同地区血清型分布差异很大， 其中b 型流感嗜血杆菌致病性最强可以造成严重的脑膜炎和脓毒症等。 在一些发达 国家， 已经使 用b型H.influenzae结合疫苗进行常规免疫， 并显著降低了与b型H.influenzae相关的疾病 的发病率， 但大部分国家的发病率仍然较高。 目前， 传统的细菌培养法是检测流感嗜血杆菌 的金标准， 但流 感嗜血杆菌是苛养菌， 培样营养要求高， 除需厌 氧环境外还需要一些特殊的 生长因子， 且培养时间较长， 操作工序繁杂， 因此流感嗜血杆菌培养分离率一直较低。 这无 疑延误患者的诊断与治疗时间并加速病情的恶化， 快速、 准确检测流感嗜血杆菌并能鉴别 出流感嗜血 杆菌分型的方法迫在眉睫。 [0003]随着分子诊断技术的快速 发展， PCR技术已经被广 泛应用于各种微生物检测。 TIAN   Guo Zhong建立了基于16S  RNA基因检测流感嗜血杆菌的PCR方法。 该方法检出流感嗜血杆 菌敏感性为97.53％， 但该方法不能鉴别出荚膜型和非荚膜型的流感嗜血杆菌。 R.J.VAN   KETEL等基于 Omp6和bexA基因建立了PCR检测荚膜型和非荚膜型流 感嗜血杆菌的方法， 该方 法根据荚膜相关蛋白bexA基因只存在于荚膜型流 感嗜血杆菌， Omp6基因存在于所有流 感嗜 血杆菌中， 成功建立了能够区分不同分型流感嗜血杆菌的P CR方法。 但该方法依赖于昂贵的 仪器设备和专业的操作技术人员。 Qilong  Cao等人建立了基于Omp6基因检测流 感嗜血杆菌 的MCDA‑LFB(the multiple  cross displacement  amplification  and nanoparticle ‑ based lateral flow biosensor)方法， 该方法能在58 –65℃反应1h， 结合胶体金试纸条的 方法快速检测流 感嗜血杆菌。 该方法虽然不依赖于昂贵的仪器设备， 但存在引物设计复杂、 反应时间较长以及假阳性 等风险。 [0004]重组酶聚合酶扩增(Recomb inase Polymerase  Amplication， RPA)技术是最近兴 起的恒温扩增技术， 与其他技术相比该技术具有更好的特异性、 灵敏度和操作便携性。 RPA 利用重组酶打开双链并使引物与目的片段结合， 利用具有链置换活性的聚合酶Bsu识别引 物3’端进行稳定扩增， 只需在30 ‑45℃反应20min即可获得大量的扩增产物。 因此， 该技术不 依赖于精密的仪器设备和专 业的操作人员。 RPA扩增产 物可以使用凝胶电泳、 荧光检测法和 胶体金试纸条法。 与凝胶电泳、 荧光检测法等不同的是， 胶体金试纸条该技术是利用抗原 ‑ 抗体结合原理实现扩增产 物的检测。 通过在RPA反应体系中加入一条5 ’端标记FITC的探针， 并使反向引物的5 ‘端标记Biotin， 以获得两端均带有标记的扩增产物。 并将扩增产物使用 特异性标记的试纸条检测， 根据检测线 是否显色实现检测扩增产 物的目的。 RPA 技术与胶体说　明　书 1/8 页 3 CN 114574603 A 3