(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210312967.8 (22)申请日 2022.03.28 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 丁芳　霍妍妍　李晓婷　洪霓　 王国平　 (74)专利代理 机构 武汉智嘉联合知识产权代理 事务所(普通 合伙) 42231 专利代理师 姜婷 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/94(2006.01) (54)发明名称 百合病毒的多重RT-PCR检测试剂盒及检测 方法 (57)摘要 本发明公开了百合病毒的多重RT ‑PCR检测 试剂盒及检测方法， 检测试剂盒中包括序列如 SEQ ID NO:1～18所示的能特异性检测九种百合 病毒的引物对中的至少四对， 所述九种百合病毒 为CMV、 LSV、 PlAMV、 LMoV、 LCrV ‑1、 LAV‑1、 LRoV‑1、 LCaV‑1和LCaV‑2， 配合优化后的检测条件， 能实 现9种病毒的同时检测， 不仅准确率高、 重复性 好， 而且耗时短、 检测费用低廉。 权利要求书2页 说明书7页 序列表6页 附图4页 CN 114717360 A 2022.07.08 CN 114717360 A 1.一种百合病毒的多重RT ‑PCR检测试剂盒， 其特征在于， 包括以下九对引物中的至少 四对： 用于扩增C MV的特异性引物对， 其序列如SEQ  ID NO:1～2所示； 用于扩增LSV的特异性引物对， 其序列如SEQ  ID NO:3～4所示； 用于扩增LMoV的特异性引物对， 其序列如SEQ  ID NO:5～6所示； 用于扩增PlAMV的特异性引物对， 其序列如SEQ  ID NO:7～8所示； 用于扩增LA V‑1的特异性引物对， 其序列如SEQ  ID NO:9～10所示； 用于扩增LRoV ‑1的特异性引物对， 其序列如SEQ  ID NO:11～12所示； 用于扩增LCaV ‑1的特异性引物对， 其序列如SEQ  ID NO:13～14所示； 用于扩增LCaV ‑2的特异性引物对， 其序列如SEQ  ID NO:15～16所示； 用于扩增LCr V‑1的特异性引物对， 其序列如SEQ  ID NO:17～18所示。 2.根据权利 要求1所述百合病毒的多重RT ‑PCR检测试剂盒， 其特征在于， 所述九对引物 的摩尔比为： CMV∶ LSV∶ LMoV∶PlAMV∶ LAV ‑1∶ LRoV‑1∶ LCaV‑1∶ LCaV‑2∶ LCrV‑1＝7∶ 4∶6∶ 4∶5∶6∶ 5∶ 4∶ 5。 3.一种检测百合病毒的多重RT ‑PCR方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1、 提取百合样品的总RNA； S2、 取总RNA通过逆转录酶合成cDNA； S3、 使用权利要求1所述检测试剂盒中的引物对步骤S2所得样品进行PCR扩增， 产物进 行琼脂糖凝胶电泳检测； 当出现210bp大小的条带时， 说明百合样品中含有CMV； 当出现330bp大小的条带时， 说 明百合样品中含有LCaV ‑2； 当出现418bp大小的条带时， 说明百合样品中含有LSV； 当出现 496bp大小的条带时， 说明百合样品中含有PlAMV； 当出现588bp大小的条带时， 说明百合样 品中含有LMoV； 当出现656bp大小的条带时， 说明百合样品中含有LAV ‑1； 当出现710bp大小 的条带时， 说明百合样品中含有LCaV ‑1； 当出现814bp大小的条带时， 说明百合样品中含有 LRoV‑1； 当出现8 84bp大小的条 带时， 说明百合样品中含有LCr V‑1。 4.根据权利要求3所述检测百合病毒的多重RT ‑PCR方法， 其特征在于， 步骤S1具体为： 将百合叶片研磨后与Trizol混匀， 离心取上清， 加入氯仿抽提； 离心取上清， 加入异丙醇混 匀， 沉降后离心弃上清； 采用乙醇洗涤沉淀， 再在沉淀中加入DEPC水使沉淀溶解， 即为样 品 总RNA。 5.根据权利要求3所述检测百合病毒的多重RT ‑PCR方法， 其特征在于， 步骤S2具体为： 取步骤S1制备的总RNA， 加 入随机引物pd(N)6和DEPC水， 先沸水浴再迅速冷却后， 加 入反转 录混合液， 吸打 混匀、 瞬离； 37℃水浴1～1.5 h后， 先沸水浴再迅速冷却， 瞬离即得。 6.根据权利 要求5所述检测百合病毒的多重RT ‑PCR方法， 其特征在于， 所述反转录混合 液包括： 4μL5 ×M‑MLV反应缓冲液、 1μL2.5mM  dNTPs、 0.5μL40U/μL  RNA酶抑制剂、 0.5μ L200U/ μL M‑MLV和4 μLDEPC水， 按总体积10 μL计。 7.根据权利要求3所述检测百合病毒的多重RT ‑PCR方法， 其特征在于， 步骤S3所述PCR 扩增的体系为： 共25μL， 12.5μL  2×Taq Master Mix， 0.15μL～0.40μL引物， 1.5μL  DNA/ cDNA， ddH2O余量。 8.根据权利要求3所述检测百合病毒的多重RT ‑PCR方法， 其特征在于， 步骤S3所述PCR权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114717360 A 2扩增的程序为： 95℃ 预变性5min； 95℃变性30s， 50～62℃退火30s， 72℃延伸15～60s， 35个 循环； 72℃完全延伸10mi n。 9.根据权利 要求8所述检测百合病毒的多重RT ‑PCR方法， 其特征在于， 所述退火的温度 为50℃。 10.根据权利要求3所述检测百合病毒的多重RT ‑PCR方法， 其特征在于， 所述产物在 2.0％琼脂糖凝胶电泳上进行电泳检测。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114717360 A 3