(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210307030.1 (22)申请日 2022.03.25 (71)申请人 郑州大学第一附属医院 地址 450002 河南省郑州市二七区建 设东 路50号 (72)发明人 夏艳洁　时盼来　冯银　孔祥东　 (74)专利代理 机构 郑州市华翔专利代理事务所 (普通合伙) 41122 专利代理师 张爱军 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种荧光定量检测NR0B1基因拷贝数目的方 法及试剂盒和应用 (57)摘要 本发明提供一种荧光定量检测NR0B1基因拷 贝数目的方法及试剂盒和应用。 所述引物组合物 由NR0B1基因和内参基因GAPDH的引物组成， 包 括： 第1外显子头部正向引物： SEQID  NO： 1、 第1外 显子头部反向引 物： SEQ ID NO： 2、 第1外显子尾 部正向引物： SEQ  ID NO： 3、 第1外显子尾部反向 引物： SEQ ID NO： 4、 第2外显子正向引物： SEQ  ID  NO： 5、 第2外显子反向引物： SEQ  ID NO： 6； 正向引 物GAPDH‑F： SEQ ID NO： 7、 反向引物GAPDH ‑R： SEQ  ID NO： 8。 本发明检测方法能有效、 准确的检测出 NR0B1基因的拷贝数目， 检测结果与MLPA分析方 法一致， 准确率为100％。 本发明试剂盒可在同一 反应体系和反应条件下对NR0B1基因第1和第2 外 显子同时进行检测， 结果可读性好， 分析、 检测过 程简单、 高效。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图2页 CN 114717304 A 2022.07.08 CN 114717304 A 1.一种检测NR0B1基因拷贝数目的引物组合物， 其特征在于， 所述引物组合物由NR0B1 基因的引物和内参基因GAP DH的引物组成； 所述NR0B1基因的引物： 由第1外显子头部正向引物NR0B1 ‑E1.1F， 序列如SEQ  ID NO： 1 所示； 第1外显子头部反向引物NR0B1 ‑E1.1R， 序列如SEQ  ID NO： 2所示； 第1外显子尾部正向 引物NR0B1 ‑E1.2F， 序列如SEQ  ID NO： 3所示； 第1外显子尾部反向引物NR0B1 ‑E1.2R， 序列如 SEQ ID NO： 4所示； 第2外显子正向引物NR0B1 ‑E2F， 序列如SEQ  ID NO： 5所示； 第2外显子反 向引物NR0B1 ‑E2R， 序列如SEQ  ID NO： 6所示组成； 所述内参基因GAPDH的引物： 由正向引物GAPDH ‑F， 序列如SEQ  ID NO： 7所示； 反向引物 GAPDH‑R， 序列如SEQ  ID NO： 8所示组成。 2.如权利要求1所述的引物组合物在制备用于检测NR0B1基因拷贝数目的试剂盒中的 应用。 3.如权利 要求2所述的应用， 其特征在于， 采用2‑ΔΔCT相对定量方法计算待测样品NR0B1 基因的拷贝数目。 4.一种用于检测NR0B1基因拷贝数目的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括如权利要 求1所述的引物组合物、 DNA模板和荧 光定量PCR反应用试剂。 5.如权利要 求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述荧光定量PCR反应用试剂包 括： MgCl2存 储液、 DNA聚合酶、 dNTPs存储液、 PCR反应缓冲液、 SYBR  Green I荧光染料、 ROX荧光染料中的 任一种或两种及以上的组合。 6.如权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述引物组合物中各引物的终浓度均为 150nM。 7.如权利要求 4所述的试剂盒， 其特 征在于， 所述DNA模板的浓度为 40ng/ μL。 8.一种用于检测NR0B1基因拷贝数目的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)提取待测样品的DNA； (2)以权利 要求1中所述的引物组合物为引物， 用荧光定量PCR方法检测NR0B1基因的拷 贝数目。 9.如权利 要求8所述的方法， 其特征在于， 所述荧光定量PCR方法的反应程序为： 95℃预 变性4min； 95℃变性15s， 60℃退火30s， 40个循环； 95℃变性15s， 60℃退火1min后逐渐升温 至95℃， 升温速度0.15℃/s， 监测每一 步的荧光信号来制作溶解曲线， 结束反应。 10.如权利要求8所述的方法， 其特征在于， 采用2‑ΔΔCT相对定量方法计算待测样品 NR0B1基因拷贝数目； ①当2‑△ △CT理论值为0， 实际值 为0～0.2时， 表示所检测标品NR0B1基因拷贝数目为0； ②当2‑△ △CT理论值为1， 实际值 为0.8～1.2时， 表示所检测标品NR0B1基因拷贝数目为1； ③当2‑△ △CT理论值为2， 实际值 为1.8～2.2时， 表示所检测标品NR0B1基因拷贝数目为2。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114717304 A 2一种荧光定量 检测NR0B1基因拷贝数目的方 法及试剂盒和 应用 技术领域 [0001]本发明涉及一种荧光定量检测NR0B1基因拷贝数目的方法及试剂盒和应用， 属于 遗传病基因检测领域。 背景技术 [0002]X染色体连锁先天性肾上腺发育不良是由NR0B1基因(又称DAX1基因)突变引起的 罕见的先天性类固醇代谢病， 呈X染色体连锁隐性遗传， 男性 发病， 女性携带， 发病率约为 1: 140000‑1:1200000， 可导致原发性糖皮质激素及盐皮质激素缺乏， 婴儿期及儿童早期多表 现为失盐症状， 临床多表现多体重不增或下降、 呕吐、 腹泻、 脱水、 嗜睡、 皮肤色素沉着等表 现， 血液生化检查结果常提示严重的高钾、 低钠、 代谢性酸中毒， 与先天性肾上腺皮质增生、 醛固酮减少症、 Addison病表现有所重叠， 极易误诊。 由于患儿肾上腺皮质激素不足， 严重时 可出现肾上腺皮质危象而威胁生命。 因此， 及时准确的诊断和治疗尤为重要。 [0003]NR0B1基因包含2个外显子和1个内含子， 编码由470个氨基酸 组成分子量约为53KD 的蛋白质， 该蛋白属细胞核受体超家族的一种孤儿核蛋白。 N R0B1是调节肾上腺发育的重要 转录因子， 存在与垂体分泌促性腺激素 的细胞和下丘脑核团中， 在肾上腺及性腺上起糖皮 质激素合 成抑制剂的作用。 NR0B1基因定位于Xp21.2， 正常女性有2个基因拷贝， 正常男性仅 有1个拷贝。 因此， 当男性个体NR0B1基因拷贝数目减少时， 可导致体内NR0B1 蛋白完全缺失， 发生X染色体连锁先天性肾上腺发育不良疾病； 而女性NR0B1基因单拷贝携带者在生育时， 如妊娠胎儿为男性， 则有50％的概率会发生X染色体连锁先天性 肾上腺发育不良疾病。 因 此， NR0B1基因拷贝数目的检测具有重要的临床意 义。 [0004]对于NR0B1基因缺失的检测， 通常采用的方法有两种： (1)PCR ‑Sanger测序法： 针对 NR0B1基因缺 失位置的上下游序列设计特异性的引物进行P CR扩增， 再通过琼脂糖电泳鉴定 PCR产物， 且对于NR0B1基因杂合缺失的个体， 需要进一步对电泳产 物进行回收， 并对回收产 物进行测序。 (2)多重连接酶扩增反应技术(multiplex  ligation ‑dependent  probe  amplification， MLPA)法： 通过探针与样本DNA杂交， 杂交探针之间相互连接和完整探针的 多重PCR扩增， 最终通过毛细管电泳检测多重扩增产物的片段大小。 但是， 这两种方法程序 较为复杂， 检测周期较长， 且第2种 方法依赖于进口的商品化试剂盒， 检测成本较高。 因此， 本领域仍然需寻求一种新的检测NR0B1基因拷贝数目的方法， 降低检测成本， 简化操作流 程， 提高时效性。 发明内容 [0005]针对现有技术的不足， 本发明的目的是提供一种荧光定量检测NR0B1基因拷贝数 目的方法及试剂盒和应用。 利用本发 明的NR0B1特异 性引物， 通过荧光定量P CR扩增， 可以实 现对NR0B1基因拷贝数 目的检测， 便于发现男性中NR0B1缺失导致的X染色体连锁先天性肾 上腺发育不良患者和女性中NR0B1拷贝数目减少的X染色体连锁先天性肾上腺发育不良携说　明　书 1/5 页 3 CN 114717304 A 3