(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210305145.7 (22)申请日 2022.03.25 (71)申请人 百济盛 （杭州） 生物科技有限责任公 司 地址 311200 浙江省杭州市萧 山区萧山经 济技术开发区明星路371号2幢1508-1 室 (72)发明人 郭长生　 (74)专利代理 机构 杭州鼎乎专利代理事务所 (普通合伙) 33377 专利代理师 方涛 (51)Int.Cl. C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种靶向探 针及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明适用于分子诊断技术领域， 提供了一 种靶向探针及其制备方法和应用， 该靶向探针的 制备方法包括以下步骤： 将含非突出脂肪胺基团 的核苷酸类似物用酶催化插入到单链或双链 DNA， 产生胺基修饰的DNA片段； 用化学方法将具 有胺反应活性的荧光标记所述胺基修饰的DNA片 段， 得到所述靶向探针。 本发明可以通过调节aa ‑ dUTP和dTTP比例很好地把控探针的重复性和稳 定性， 其便于规模化生产， 而且对颜料要求不高， 不同颜料标记的效果相似。 另外， 本发明制得的 靶向探针信号大， 亮点强， 容易观察， 重复性和稳 定性较好， 应用更广泛， 其能够用于直接检测宫 颈癌和膀胱癌等肿瘤早期标记 物。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 114717293 A 2022.07.08 CN 114717293 A 1.一种靶向探针的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 将含非突出脂肪胺基团的核苷酸类似物用酶催化插入到单链或双链DNA， 产生胺基修 饰的DNA片段； 用化学方法将具有胺反应活性的荧光标记所述胺基修饰的DNA片段， 得到所述靶向探 针。 2.根据权利要求1所述的一种 靶向探针的制备方法， 其特征在于， 将含非突出脂肪胺基 团的核苷酸类似物用酶催化插入到单链或双链DNA， 产生胺基修饰的DNA片段的步骤， 具体 包括： 将靶基因DNA置于添加有含非突出脂肪胺基团的核苷酸类似物的缺口翻译反应液中进 行孵育， 得到胺基修饰的DNA片段； 其中， 所述缺口翻译反应液包括MgCl2、 DTT、 BSA、 dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP、 含非突出脂肪 胺基团的核苷酸类似物、 酶催化用酶、 DNase  I和缓冲液。 3.根据权利要求1或2所述的一种靶向探针的制备方法， 其特征在于， 所述步骤中， 酶催 化中所使用的酶为逆转录酶 或DNA聚合酶I。 4.根据权利要求2所述的一种 靶向探针的制备方法， 其特征在于， 所述含非突出脂肪胺 基团的核苷酸类似物与dT TP的摩尔比为1:1 ‑9:1。 5.根据权利要求1或2或4所述的一种靶向探针的制备方法， 其特征在于， 所述含非突出 脂肪胺基团的核苷酸类似物为a a‑dUTP。 6.根据权利要求1所述的一种 靶向探针的制备方法， 其特征在于， 用化学方法将具有胺 反应活性的荧 光标记所述胺基修饰的DNA片段， 得到所述靶向探针的步骤， 具体包括： 使用胺反应颜料化学 标记所述胺基修饰的DNA片段， 得到所述靶向探针。 7.一种如权利要求1 ‑6中任一项所述制备 方法制得的靶向探针。 8.一种如权利要求7 所述的靶向探针在制备肿瘤分子诊断试剂盒中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114717293 A 2一种靶向探针及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于分子诊断技 术领域， 尤其涉及一种靶向探针及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]目前国内比较成熟的分子诊断技术主要是PCR， 其中传染病诊断产品最多。 近年 来， 基因测序公司随着国内正常的开 发， 出现快速发展的局面。 但目前在常规病理切片的基 础上， 对组织细胞的基因状态进 行分子诊断， 国际上标准的做法是用基因原 位杂交方法， 相 对与PCR和基因测序， 分子探针为核心的原 位杂交技术应用还不够 普遍， 国内研发和生产分 子探针公司的数量有限， 制备技术近年来没有创新和发展。 以往对基因探针的制作及应用 有两大技 术： [0003](1)现有显色原位杂交技术(FISH)的生产 厂家主要是美国阿伯特(Abbo  tt)公司， 其特点是将人类基因组DNA大片段经小片段化后， 不经纯化， 直接标记荧光染料。 由于探针 内含有内源性干扰序列， 因此背景很高， 必需加一外源性干扰序列来减低背景。 即使如此， 仍然会有一些非特异性杂交信号显现， 而且价格昂贵， 限制了在发展中国家的推广应用。 [0004](2)改进显色原位杂交技术(CISH)的生产厂家主要是美国英杰(Invitrog  en)公 司， 该技术的特点是将人类基因组DNA大片段经小片段化后， 再经分层次反复提取并纯化， 目标是将尽可能多的内源性干扰序列去除。 其工艺繁琐复杂， 耗时耗力， 可是仍然有一定量 的干扰序列不能去除干净， 只能达到90 ‑95％的纯度。 由于探针内含有内源性干扰序列， 因 此往往有相当程度的非特异 性杂交信号显现。 因其周期 长， 效率低， 赶不上新的肿瘤标志物 的发展速度。 [0005]荧光强度， 目标探针的特异性， 探针的稳定性， 荧光淬灭等多种因素都探针最终的 质量， 近年来， 很多公司的研发团队都在尝试改进现有工艺， 寻找能够增加和控制荧光标记 核苷酸的标记效率(degre e of labeling， DOL)和稳定性的方法。 [0006]目前， 荧光原位杂交(FISH1)探针现有常规方法是酶催化直接将颜色标记的核苷 酸整合到探针序列。 但现有这种常规方荧光或其它颜色标记的核苷酸插入的效率低， 一般 每100个核苷酸最多 可以插入2 ‑3个荧光标记核苷 酸， 不同颜色标记核苷 酸之间插入效率差 异大， 而且不容易进行对比。 目前常用的CyTM3和C y5两种颜色标记的核苷酸在使用中插入 效率就很低。 发明内容 [0007]本发明实施例的目的在于提供一种靶向探针的制备方法， 旨在 解决背景技术中提 出的问题。 [0008]本发明实施例是这样实现的， 一种靶向探针的制备 方法， 其包括以下步骤： [0009]将含非突出脂肪胺基团的核苷酸类似物用酶催化插入到单链或双链DNA， 产生胺 基修饰的DNA片段； [0010]用化学方法将具有胺反应活性的荧光标记所述胺基修饰 的DNA片段， 得到所述靶说　明　书 1/6 页 3 CN 114717293 A 3