(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210306494.0 (22)申请日 2022.03.25 (71)申请人 西南交通大 学 地址 610031 四川省成 都市二环路北一段 (72)发明人 周嘉裕　廖海　张田　安秋菊　 黄德娅　 (74)专利代理 机构 北京正华智诚专利代理事务 所(普通合伙) 11870 专利代理师 周芸婵 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种暗紫贝 母的Indel标记及其应用 (57)摘要 本发明首次发现以该Indel标记引物与探针 为核心的qPCR方法能够特异性鉴定暗紫贝母， 仅 有暗紫贝母在出现扩增曲线， 呈现阳性结果， 其 它贝母品种显示为阴性结果。 可用于暗紫贝母基 原植物与药材的特异性分子鉴定。 本发明具有以 下优点： 特异性好， 仅有暗紫贝母在出现扩增曲 线， 呈现阳性结果； 灵敏度高， qPCR的最低检测浓 度(DNA)为0.1543ng/μL； 步骤少、 检测周期短： 操作时间仅需1.5 ‑2.5小时； 重现性好： 已经进行 了10次以上的生物学重复， 重现性达 到100％。 权利要求书1页 说明书8页 附图2页 CN 114634992 A 2022.06.17 CN 114634992 A 1.一种用于鉴定暗紫贝母 的Indel标记， 其特征在于， 围绕该Indel标记设计引物的核 苷酸序列如SEQ  ID NO： 1与SEQ  ID NO： 2所示， 设计的Taqman ‑MGB探针的核苷酸序列如SEQ   ID NO： 3所示。 2.根据权利要求1所述的Indel标记引物与探针， 其特征在于， 该Indel标记的获得是通 过12种贝母属植物的叶绿体基因组序列比对， 发现暗紫贝母的trnG ‑GCC‑trnR‑UCU基因区 间有一段长度为 47bp的插 入序列设计的。 3.以权利 要求1建立一种基于该Indel标记引物与探针用于暗紫贝母鉴定的PCR检测方 法， 包括如下步骤： 1)提取待测样品基因组DNA； 2)以待测样品基因组DNA为模板， 利用上述 Indel标记引物与探针进行qPCR扩增； 3)根据凝胶电泳结果是否出现扩增曲线来判定样品 是否为暗紫贝母。 4.根根据权利要求1、 2及3所述暗紫贝母的Indel标记及其应用， 其特征在于， 用于暗紫 贝母基原植物的快速分子鉴定 。 5.根据权利 要求1、 2及3所述暗紫贝母的Indel标记及其应用， 其特征在于， 用于暗紫贝 母药材的快速分子鉴定 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114634992 A 2一种暗紫贝母的Indel标记及其应用 技术领域 [0001]本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域， 公开了一种暗紫贝母的Indel标记及 利用该标记建立的qPCR方法， 能够准确区分暗紫贝母与其它基原贝母品种， 有效保证药材 基原的准确性与质量 安全。 背景技术 [0002]以植物、 动 物来源的中药材在生物学上物种的确定， 称之为基原。 如果中药材标准 来源项下收载有两个及以上基原的情况称之为多基原中药材。 尽管多基原缓解了中药材的 市场空缺， 然而多基原的混合使用严重影响中药 临床疗效的有效性、 安全性与质量可控性。 为此， 国家食品药品监督管理总局于2016年颁布 《中药配方颗粒管 理办法(征求意见稿)》 规 定：“对栽培、 养殖或野生采集的药用动植物， 应准确鉴定其物种， 包括亚种、 变种或品种， 不 同种的中药 材不可相互混用 ”。 [0003]贝母是典型的多基原药材， 是百合科(Liliaceae)贝母属(Fritillaria  L.)多种 植物的鳞茎， 极易混淆与掺杂。 2020年版 《中国药典》 收载药用贝母品种有川贝母 (Fritilaria  cirrhosa  D.Don)、 伊贝母(Fritillariae  pallidiflorae)、 浙贝母 (Fritillaria  thunbergii)、 平贝母(Fritillaria  ussuriensis)与湖北贝母 (Fritillaria  hupehensis)等品种。 其中， 川贝母药材有6种基原， 包括暗紫贝母 (F.unibracteata  P.K.Hsiao&K.C.Hsi a)、 卷叶贝母(Fritill aria cirrhosa)、 、 甘肃贝母 (F.przewalskii)、 梭砂贝母(F.delavayi)、 太白贝母(F.taipaien sis P.Y.Li)和瓦布贝母 (F.unibracteata  Hsiaoet K.C.Hsia  var.wabuen sis)。 《中国植物志》 中收载， 暗紫贝母主 要分布于中国四川西北部(阿坝州、 甘孜州)， 及青海与四川省接壤处， 生于海拔3200 ‑4500 米的草地上。 虽然多基原的使用， 部分满足了市场需要， 然而由于基原较多， 一旦发生不同 品种或不同基原贝母混用， 会严重影响临床疗效与安全性， 极大地危害消费者及病患者利 益， 因此急需建立适合于不同基原贝母的准确、 高效鉴定方法。 目前， 2020版 《中国药典》 中 “川贝母”项下以有PCR ‑RFLP分子鉴定方法， 但缺少具体的对暗紫贝母的分子鉴定方法。 基 于此目的， 本发明建立一种能够准确 鉴定暗紫贝母的分子生物学方法， 能够有效区分暗紫 贝母与非暗紫贝母(包括 其余5种川贝母基原、 非川贝母及一些川贝母近缘 易混种)。 [0004]暗紫贝母的鉴定主要依赖于传统的性状鉴定方法， 此法主要从样品的鳞茎色泽、 脐点形状、 鳞叶数量、 抱合紧密度、 顶端开合、 长 短以及气味等特征进 行观察比较， 需要丰富 的鉴定经验， 且栽培品形态标准性较差。 再加上人为干预栽培导致不同贝母的相似度不断 上升， 鉴别难度不断增加， 一般需要 结合其他分析鉴定技术进 行鉴别。 化学方法如高效液相 色谱以及液质联用技术， 耗费材料多， 且需要 大型仪器支持， 推广难度大， 因此， 开 发更加便 捷、 快速的检测方法以满足药 材市场监控需求是刻不 容缓的。 发明内容 [0005]本发明基于川贝母(6种基原)、 伊贝母(2种基原， 分别为伊犁贝母与新疆贝母)、 浙说　明　书 1/8 页 3 CN 114634992 A 3