(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210305726.0 (22)申请日 2022.03.25 (71)申请人 江苏省农业科 学院 地址 210014 江苏省南京市玄武区钟灵街 50号 (72)发明人 宁宇　刘静　徐海　刘之洋　 夏彭飞　陈龙正　袁希汉　 (74)专利代理 机构 北京汇捷知识产权代理事务 所(普通合伙) 11531 代理人 李鑫 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种与苦瓜全雌性相关的KASP分子标记及 其应用 (57)摘要 本发明公开了一种与苦瓜全雌性相关的 KASP分子标记及其应用。 该分子标记位于苦瓜基 因组1号染色体上的24645998位， 在24645998位 发生T向C的点突变； 其中， 用于扩增所述分子标 记的KASP引物组包括正向引物F 1、 正向引物F2和 反向引物R； 其中， 所述正向引物F 1的核苷酸序列 如SEQ ID NO:7所示， 所述正向引物F2的核苷酸 序列如SEQ  ID NO:8所示， 所述 反向引物R的核苷 酸序列如SEQ  ID NO:4所示。 该KASP分子标记可 应用在苦瓜性别的鉴定、 苦瓜全雌株的筛选或者 在育种中， 具有操作简便、 成本低廉、 特异性强、 稳定性高的特点。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 CN 114427007 A 2022.05.03 CN 114427007 A 1.一种与苦瓜全雌性相关的KASP分子标记， 其特征在于， 所述分子标记位于苦瓜基因 组1号染色体上的24645998位， 在24645998位发生T向C的点突变； 其中， 用于扩增所述分子 标记的KASP引物组包括正 向引物F1、 正向引物F2和反向引物R； 其中， 所述正向引物F1的核 苷酸序列如SEQ  ID NO:7所示， 所述正向引物F2的核苷酸序列如SEQ  ID NO:8所示， 所述反 向引物R的核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示。 2.一种与苦瓜全雌性相关的KASP引物 组， 其特征在于， 该引物组包括正向引物F1、 正向 引物F2和反向引物R； 其中， 所述正向引物F1的核苷 酸序列如SEQ  ID NO:7所示， 所述正向引 物F2的核苷酸序列如SEQ  ID NO:8所示， 所述反向引物R的核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示。 3.一种用于鉴定苦瓜性型的试剂盒， 其特征在于， 该试剂盒包含权利要求2所述的KASP 引物组。 4.权利要求1所述的KASP分子标记、 权利要求2所述的KASP引物或权利要求3所述的试 剂盒在苦瓜性别的鉴定、 苦瓜全雌株的筛 选或者在育种中的应用。 5.一种利用KAS P分子标记来 鉴定苦瓜性别的方法， 其特 征在于， 该 方法包括以下步骤： (1)以待测样品基因组DNA为模板， 利用 权利要求1所述的KASP引物组进行PCR扩增反 应， 获得扩增产物； (2)对扩增产物进行检测与分析。 6.如权利要求5所述的方法， 其特征在于， 在步骤(1)中， 所述PCR扩增反应为 TouchdownPCR扩增， 其中， PCR反应体系总体积为10 μL， 包括2*KASP  mastermix  5 μL， PrimerMix  2.5 μL， 模板DNA (30ng/ μL)2.5 μL； PCR扩增程序为： 94℃预变性10min； 94℃变性20s； 61℃～56℃退火延伸60s， 共10个 touchdown循环， 每个循环退火延伸温度降0.8℃； 第二轮循环， 94℃变性20s； 55℃退火延伸 60s， 26个循环。 7.如权利要求5所述的方法， 其特征在于， 在步骤(2)中， 所述检测为对扩增产物进行荧 光检测， 其中， T/T为表现为全雌株基因型， T/C为表现为雌雄同株的杂合基因型； C/C为表现 为纯合的雌雄同株 基因型。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114427007 A 2一种与苦 瓜全雌性相关的KASP分子标记及其应用 技术领域 [0001]本发明属于生物分子标记技术领域， 尤其涉及一种与苦瓜全雌性相关的KASP分子 标记及其应用。 背景技术 [0002]苦瓜(Momordica  charantia  L.)属葫芦科苦瓜属， 在我国是一种深受消费者喜爱 的特色蔬菜作物。 苦瓜富含维生素、 苦瓜素、 皂苷、 多肽、 生物碱、 黄酮等物质， 具有祛湿、 降 血糖、 抗肿瘤 及提高免疫力等多种药用功效。 [0003]商品苦瓜 由雌花的子房部位发育而成， 因此， 全雌株具有熟性早、 产量高的优点， 符合设施栽培对苦瓜品种的要求。 此外， 以全雌株为母本进行杂交制种时利用蜜蜂授粉代 替人工去雄杂交， 可有效降低制种成本， 并且在理论上可使杂交率达到100％， 提高制种质 量。 因此， 全雌性在苦瓜新品种创制及配套的制种过程中具有巨大 的应用价值和广阔的应 用前景。 [0004]利用分子标记辅助选择手段对苦瓜全雌性进行早期筛选鉴定可大大提高育种选 择效率， 加速育种进程。 尽管目前已经有苦瓜全雌性相关分子标记的报道， 但要么遗传距离 较远， 筛选准确率不高， 要么操作复杂， 难以满足当前高通量快速育种的需求。 KASP (Kompetitive  Allele‑Specific PCR， 竞争性等位基因特异性PCR)技术具有准确性高、 位 点适应性 强、 成本低、 适合检测大量样 本SNP位点等优势， 因此， 开 发与苦瓜全雌性紧密连锁 的KASP分子标记对于提高我国苦瓜全雌育种效率和育种水平具有重要意 义。 发明内容 [0005]为了克服现有技术的缺点， 本发明的首要目的在于提供一种与苦瓜全雌性相关的 KASP分子标记。 [0006]本发明的再一目的在于提供 上述与苦瓜全雌性相关的KAS P分子标记的应用。 [0007]本发明是这样实现的， 一种与苦瓜全雌性相关的KASP分子标记， 所述分子标记位 于苦瓜基因组1号染色体上的24645998位， 在24645998位发生T向C的点突变； 该位置及上下 游各200bp的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示； [0008]其中， 用于扩增所述分子标记的KASP引物组包括正向引物F1、 正向引物F2和反向 引物R； 所述正向引物F1的核苷酸序列如SEQ  ID NO:7所示， 所述正向引物F2的核苷酸序列 如SEQ ID NO:8所示， 所述反向引物R的核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示； [0009]所述正向引物F1为KASP24645998 ‑F1及其5 ’端与荧光接头序列连接构成， KASP24645998 ‑F1的核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示， 所连接的荧光接头为FAM荧光接头， FAM荧光接头的核苷酸序列如SEQ  ID NO:5所示； [0010]所述正向引物F2为KASP24645998 ‑F2及其5’端与又一荧光接头序列连接构成， KASP24645998 ‑F2的核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示， 所连接的荧光接头为HEX荧光接头， HEX荧光接头的核苷酸序列如SEQ  ID NO:6所示；说　明　书 1/6 页 3 CN 114427007 A 3