(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210292771.7 (22)申请日 2022.03.24 (71)申请人 南京师范大学 地址 210024 江苏省南京市 鼓楼区宁海路 122号 (72)发明人 黄新琦　闫元元　赵军　蔡祖聪　 张金波　 (74)专利代理 机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 专利代理师 丁静静 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/77(2006.01) (54)发明名称 一种尖孢镰刀菌黄瓜专化型LAMP引物及检 测试剂盒与应用 (57)摘要 本发明公开了一种尖孢镰刀菌黄瓜专化型 LAMP引物及检测试剂盒与应用， 属于生物技术领 域。 本发明基于LAMP技术， 设计了一组尖孢镰刀 菌黄瓜专化型LA MP引物， 并公开了一种尖孢镰刀 菌黄瓜专化型LA MP试剂盒。 本发明不依 赖任何专 门的仪器设备可实现现场高通量快速检测， 用肉 眼即可判断结果， 检测成本低于荧光定量PCR。 本 发明可特异性的识别植株、 土壤和菌株等样品中 的尖孢镰刀菌黄瓜专化型， 而且准确性高、 耗时 较短、 操作简单、 成本较低， 对黄瓜枯萎病的诊断 和预防具有重要意 义， 易于基层大规模推广。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图3页 CN 114574620 A 2022.06.03 CN 114574620 A 1.尖孢镰刀菌 黄瓜专化型LAMP引物组， 其特 征在于， 包括如下引物： F3： 5’ ‑CGGATCTCTTGGTTCTGGC‑3’； B3： 5’ ‑TGGAAGCTCGACGTGAC C‑3’； FIP： 5’ ‑GGCGCAATGTGCGT TCAAAGATTGAAGAACGCAGCA AAATGC‑3’； BIP： 5’ ‑TGCCTGTTCGAGCGTCAT TTCACGAATTAACGCGAGTC CCA‑3’； LB： 5’ ‑ACCCTCAAGCACAGCT TGGT‑3’。 2.权利要求1所述尖孢镰刀 菌黄瓜专化型LAMP引物 组在检测尖孢镰刀菌黄瓜专化型中 的应用。 3.一种尖孢镰刀菌黄瓜专化型LAMP检测试剂盒， 其特征在于， 包含以下试剂： 20 ×引物 混合液、 尖孢镰刀菌 黄瓜专化型基因 组DNA、 2×LAMP MagicMix及灭菌超纯 水； 所述20×引物混合液中含有权利要求1所述的尖孢镰刀菌 黄瓜专化型LAMP引物组。 4.根据权利 要求1所述的尖孢镰刀菌黄瓜专化型LAMP检测试剂盒， 其特征在于， 所述20 ×引物混合液中各引物的浓度如下： FIP 32 μM、 BIP 32 μM、 F3 4 μM、 B3 4 μM、 LB 8 μM。 5.根据权利要求1所述的尖孢镰刀菌黄瓜专化型LAMP检测试剂盒， 其特征在于， 所述2 ×LAMP MagicMix中含有DNA聚合酶、 蓝色DNA示踪染料、 反应缓冲液。 6.权利要求3所述的尖孢镰刀菌黄瓜专化型LAMP检测试剂 盒在检测尖孢镰刀 菌黄瓜专 化型中的应用， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)提取待测样品基因 组DNA； (2)LAMP反应： 扩增反应体系： 权利 要求2所述的20 ×引物混合液1μL、 步骤(1)提取的待测样品基因组 DNA 2 μL、 2×LAMP MagicMix  10 μL， 补灭菌超纯水至2 0 μL， 并以尖孢镰刀菌黄瓜专化型基因 组DNA作为阳性对照， 以灭菌超纯 水作为阴性对照， 反应程序为： 6 5℃恒温5 0min； (3)反应结束后观察颜色的变化： 若反应结束后反应液呈蓝色， 则待测样品含有尖孢镰 刀菌黄瓜专化型； 若反应结束后反应液 呈无色或极浅 蓝色， 则待测样品不含 尖孢镰刀菌 黄瓜专化型。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114574620 A 2一种尖孢镰刀菌黄瓜专化型LAMP引物及检测试剂盒与应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种尖孢镰刀菌黄瓜专化型LAMP引物及试剂 盒与应用。 背景技术 [0002]黄瓜是葫芦科黄瓜属植物， 是我国重要的蔬菜作物。 近年来， 黄瓜产业的可持续发 展受到了土传病害的严重制约， 特别是黄瓜枯萎病。 该病是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型 (Fusarium  oxysporum  f.sp.cucumerinum)侵染引起。 该病原菌主要通过根部感染植株并 寄生在根茎中， 引起植株维管束坏死， 导致黄瓜枯萎。 即使没有宿主， 它产生的厚垣孢子也 能在土壤中长期存活， 其致病能力强、 致死率高、 危害严重。 长期以来， 黄瓜枯萎病的防治以 化学农药为主， 而发病中后期化学农药对枯萎病的防治效果甚微。 因此， 在早期快速检测尖 孢镰刀菌 黄瓜专化型 尤为重要， 为黄瓜枯萎病的及时预防和控制提供依据。 [0003]目前尖孢镰刀菌等病原菌的检测通常采用传统的形态特征鉴定方法、 常规PCR方 法及实时荧光定量PCR方法等。 传统的形态特征鉴定方法需要实验人员具备准确识别不同 菌落形态的能力， 而且往往仅凭肉 眼不能区分不同专 化型的菌落。 采用常规P CR方法及实时 荧光定量PCR方法， 需要使用昂贵的仪器 设备， 如超 净台、 PCR仪及荧光定量PCR仪等， 而且其 操作流程较复杂， 往往需要实验人员具备一定的实验技能， 不适合基层生产或现场快速诊 断。 [0004]环介导等 温扩增技术(Loop ‑mediated  isothermal  amplification， LAMP)是一种 新型的基因诊断技术， 能在等温(60 ‑65℃)条件下， 短时间内(通常是1小 时内)进行核酸扩 增。 与常规PCR相比， LAMP方法不需要模板的热变性、 温度循环、 电泳及紫外观察等过程。 LAMP法的特征是针对靶基因上的六个区域设计至少四条引物， 利用链置换型DNA聚合酶在 恒温条件下进行扩增反应， 反应能产生有色的扩增产物， 可以通过肉眼观察颜色的有无或 深浅来判断靶基因是否存在。 LAMP具有简单、 快速、 特异性 强的特点。 该技术在灵敏度、 特异 性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术， 不依赖任何专门的仪器设备实现现场高 通量快速检测， 检测成本远低于荧 光定量PCR。 发明内容 [0005]发明目的： 本发明需要解决的技术问题是提供一种快速、 高效、 便捷、 低成本、 易操 作的尖孢镰刀菌 黄瓜专化型LAMP可视化检测方法。 [0006]技术方案： 为 解决上述 技术问题， 本发明提供如下技 术方案： [0007]尖孢镰刀菌黄瓜专化型LAMP引物组， 其特征在于， 包括正向外引物 F3、 反向外引物 B3、 正向内引物FIP、 反向内引物BIP和下游 环引物LB， 引物序列如下： [0008]正向外引物F3(SEQ  ID NO:1)： 5’ ‑CGGATCTCTTGGTTCTGGC‑3’； [0009]反向外引物B3(SEQ  ID NO:2)： 5’ ‑TGGAAGCTCGACGTGAC C‑3’； [0010]正向内引物FIP(SEQ  ID NO:3)： 5’ ‑GGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTGAAGAACGCAGCAAA说　明　书 1/5 页 3 CN 114574620 A 3