(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210300874.3 (22)申请日 2022.03.24 (71)申请人 成都市动物疫病预防控制中心 地址 610000 四川省成 都市一环路西一段 七道堰街9号 (72)发明人 李敏　李桂黎　杨泽晓　周立新　 岳建国　黄云川　林鑫　李俐睿　 周潇潇　石湉　叶斌　 (74)专利代理 机构 成都帝鹏知识产权代理事务 所(普通合伙) 5126 5 专利代理师 李华 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 RHDV2荧光定量RT-PCR检测方法 (57)摘要 本发明提供了一种荧光定量RT ‑PCR检测 RHDV2的引物探针组、 试剂盒及检测方法， 属于分 子生物学技术领域。 本发明所述引物探针组是由 引物F、 引物R和探针T组成： 所述引物F的序列为： 5’ ‑GAGTGTTGATGGRTACTTC ‑3’， 所述引物R的序列 为： 5’ ‑CCCAAGTTGTACACAAGC ‑3’， 所述探针T的序 列为： 5’ ‑AGCCACCCTCATYGACCTGT ‑3’， 所述探针T 的5’端标记有荧光报告基团FAM， 3 ’端标记有荧 光淬灭基团BHQ1。 本发明提供的引物探针组及其 检测方法能够针对于兔病毒性出血症2型进行快 速检测， 所得结果 准确， 特异性 好、 灵敏度高。 权利要求书2页 说明书5页 附图3页 CN 114574633 A 2022.06.03 CN 114574633 A 1.一种荧光定量RT ‑PCR检测兔病毒性出血症2型的引物探针组， 其特征在于， 所述引物 探针组是由引物F、 引物R和探针T组成： 所述引物F的序列为： 5 ’ ‑GAGTGTTGATGGRTACTTC‑3’， 所述引物R的序列为： 5 ’ ‑CCCAAGTTGTACACA AGC‑3’， 所述探针T的序列为： 5 ’ ‑AGCCACCCTCATYGACCTGT ‑3’， 所述探针T的5 ’端标记有荧光报 告基团FAM， 3 ’端标记有荧 光淬灭基团BHQ1。 2.一种包含权利要求1所述引物探针组的时荧光定量RT ‑PCR检测兔病毒性出血症2型 的试剂盒。 3.权利要求1所述引物探针组在制备用于荧光定量RT ‑PCR检测兔病毒性出血症2型的 试剂盒中的应用。 4.一种用于兔病毒性出血症2型的荧光定量RT ‑PCR检测方法， 其特征在于， 包括如下步 骤： (1)按照病毒核酸提取试剂盒与反转录酶说明书提取RHDV2病毒基因组RNA， 以提取的 基因组RNA为模板， 反转录合成cDNA， 利用引物F和引物R进行PCR扩增VP60基因， 克隆至T载 体， 构建阳性重组T载体， 测序鉴定。 具体步骤为： 将PCR扩增产物按照试剂盒进行凝胶纯化 回收， 取4 μL胶回收产物按照T 载体连接试剂盒说明书配制反应体系， 16℃连接过夜； 取100 μ L在冰上融化的DH5a感受态细胞， 加入连接产物， 轻轻混匀， 冰上静置25min； 42℃水浴热激 45～60s， 迅速转移至冰浴中， 静置2min； 向离心管中加入700μLLB培养液， 混匀后37℃， 200rpm震荡培养1h； 3000rpm离心5min， 弃去上清700 μL， 将剩下的菌液轻轻混匀， 吸出涂布 到LB琼脂培养板(50 μg/mlAmp+)上， 37℃培养箱过 夜培养； 挑取白色单菌落到5mL  LB液体培 养基(50 μg/mlAmp+)中， 37℃培养箱过夜培养。 取2 μL培养物为模板， 进行PCR鉴定； 将PCR鉴 定阳性的菌落培 养物， 送生物技 术测序公司测序鉴定 。 (2)将步骤(1)构 建的阳性重组载体10倍梯度稀释， 以引物F和引物 R进行实时荧光定量 PCR扩增， 以模板浓度的L og值为纵坐标， 以扩增得到的Ct值作为横坐标， 制作标准曲线； (3)提取各类样本的基因组RNA， 并反转录合成cDNA， 利用引物F、 引物R和探针T进行实 时荧光定量PCR扩增， 得Ct值， 然后根据步骤(2)所 得标准曲线计算出目标片段的拷贝数。 5.根据权利要求 4所述的检测方法， 其特 征在于， 所述反转录合成cDNA的步骤为： 反应体系为10 μL， 在PCR反应管中依次加入下列反应物： 5 ×AMV反应缓冲液2 μL； 反转录 引物50 μmol/L  Oligo dT 0.5 μL； AMV反转录酶0.5 μL； 随机6核苷酸引物 100 μmol/L  0.5 μL； 无核酸酶水4.0 μL； RNA模板2.5 μL； 混匀后瞬时离心， 随后进入反转录循环37℃15min， 65℃ 5s。 6.根据权利要求4所述的检测方法， 其特征在于， 所述PCR扩增采用的荧光RT ‑PCR反应 体系为： 18 μL荧光RT‑PCR反应混合液， 组成如下：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114574633 A 27.根据权利要求6所述的检测方法， 其特征在于， 所述PCR扩增的步骤为： 将18μL荧光 RT‑PCR反应混合液加入PCR扩增管， 将2 μL  cDNA加入PCR扩增管， 加入模板后， 密封PCR管， 瞬 时离心， 将PCR扩增管放在PCR仪中， 扩增程序如下： 95℃预变性3mi n； 95℃变性10s； 59℃退火10s， 72℃延伸25s， 45个 循环。 8.根据权利要求6所述的检测方法， 其特征在于， 采用所述检测方法对兔出血症病毒2 型进行鉴定时， 方法如下： 被检样品Ct 值≤36且 出现特异 性扩增曲线， 则判定兔出血症病毒 2型核酸阳性； 当无Ct值 或Ct≥40， 则判定兔出血症病毒2型核酸阴性； 当36＜Ct值＜40且 出 现特异性扩增曲线， 则判定疑似； 对疑似样品进行重复检测， 结果仍为疑似， 则判定为兔出 血症病毒2型核酸阳性。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114574633 A 3