(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210294701.5 (22)申请日 2022.03.24 (71)申请人 浙江省疾病预防控制中心 地址 310051 浙江省杭州市滨江区滨 盛路 3399号 申请人 杭州杰毅生物技 术有限公司 (72)发明人 张严峻　 (74)专利代理 机构 浙江千克知识产权代理有限 公司 33246 专利代理师 黎双华 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种新型冠状病毒Delta变异 株检测的引物 探针组合及其应用 (57)摘要 本发明属于生物 技术领域， 涉及新型冠状病 毒核酸检测技术， 具体涉及用于一种新型冠状病 毒Delta变异株检测的引物探针组合及其应用， 引物探针组合包括针对新型冠状病毒Delta变异 株靶点设计的一对特异性扩增引物和一条特异 性识别单碱基突变的检测探针， 该引物和探针可 与新型冠状病毒N基因和人的内标Actin基因的 引物探针相组合。 本发明的引物探针组合可以实 现在一管反应中， 同时检测样 本中是否含有新型 冠状病毒核酸， 进一步的鉴别是否为新型冠状病 毒Delta变异株。 应用本发明提供的新型冠状病 毒Delta变异 株检测的引物探针组合， 对RNA核 酸 样本进行检测， 具有特异性好、 灵敏度高， 以及方 便、 快速、 准确的特点。 权利要求书1页 说明书10页 序列表8页 附图3页 CN 114561494 A 2022.05.31 CN 114561494 A 1.一种用于新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合， 其特征在于， 包括针对新 型冠状病毒Delta变异株靶点设计的一对特异 性扩增引物和一条特异 性识别单碱基突变的 检测探针， 该引物和探针可与新型冠状病毒N基因和人的内标Actin基因的引物探针相组 合。 2.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合， 其特征 在于， 所述 一对特异性扩增引物的序列选自以下： SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ  ID NO.2所示的下游引物； 或SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ  ID NO.4所示的下游引物； 或SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ  ID NO.6所示的下游引物。 3.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合， 其特征 在于， 所述一对特异性扩增引物的序列为SEQ  ID NO.5所示的上游引物和SEQ  ID NO.6所示 的下游引物。 4.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合， 其特征 在于， 核苷酸序列的Tm值比扩增引物高5～10℃， 且GC含量 为40%～70%。 5.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合， 其特征 在于， 所述特异性识别单碱基突变的检测探针其序列选自以下： SEQ ID NO.7所示的序列； 或SEQ ID NO.8所示的序列； 或SEQ ID NO.9所示的序列； 或SEQ ID NO.10所示的序列。 6.根据权利要求5所述的用于新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合， 其特征 在于， 所述特异性识别单碱基突变的检测探针序列如SEQ  ID NO.8或SEQ  ID NO.9所示。 7.根据权利要求5所述的用于新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合， 其特征 在于， 所述特异性识别单碱基突变的检测探针序列如SEQ  ID NO.9所示。 8.根据权利要求5所述的用于新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合， 其特征 在于， 所述特异性识别单碱基突变的检测探针的5 ’端由ROX修饰， 3 ’端由MGB修饰。 9.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合， 其特征 在于， 所述新型冠状病毒N基因的引物序列如SEQ  ID NO.11、 SEQ  ID NO.12所示， 探针序列 如SEQ ID NO.13所示。 10.根据权利要求1所述的用于新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合， 其特 征在于， 所述内标Actin基因的引物序列如SEQ  ID NO.14、 SEQ  ID NO.15所示， 探针序列如 SEQ ID NO.16所示。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114561494 A 2一种新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组合及其 应用 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 涉及新型冠状病毒核酸检测技术， 具体涉及用于一种 新型冠状病毒Delta变异株 检测的引物探针组合及其应用。 背景技术 [0002]随着新型冠状病毒 （Severe  acute respiratory  syndrome  coronavirus  2， SARS‑CoV‑ 2） 的不断进化和变异， 相继出现多种关切变异株(Variant  of concern， VOC)。 其中已成为公共卫生部门和民众重点关注的VOC—新型冠状病毒Delta变异株(原称 B.1.617.  2） ， 其传播能力和致病性明显提高， 并出现抗原逃逸现象， 具有传播力强、 感染潜 伏期短、 致病性强、 发病进程快等特点。 [0003]针对新型冠状病毒Delta变异株的检测， 现有技术中主要提供了新型冠状病毒ORF 基因和/或N基因作为新型冠状病毒靶基因的检出， 然后再通过二代测序技术 （NGS） 确定是 否存在突变位点来鉴别Delta变异株， 该方法准确度较高， 但 其存在的缺陷为该方法并非一 次性检出， 且成本高耗时久， 故在实际应用中很不方便 。 发明内容 [0004]为了快速有效的一步法鉴别样品中是否存在新型冠状病毒Delta变异株， 本发明 基于Taqman荧光探针法的原理技术， 针对Delta变异株的突变位点， 设计了特异性好、 灵敏 度高的引物和探针。 [0005]本发明用于准确检测新型 冠状病毒Delta变异株， 现将其靶点选择做如下说明： 新型冠状病毒Delta变异株(原称B.1.617.  2） 因其具有传播力强、 感染潜伏期短、 致病性强、 发病进程快等特点， 逐渐取代 其他VOC成为全球疫情流行株。 新型冠状病毒Delta 变异株具有 L452R、 P681R、 T19R和T478K突变， 研究显示L452R突变位于SARS ‑CoV‑2刺突蛋白 的受体结合区域， 这对进入宿主细胞至关重要， 且L452R突变增强了其膜融合活性、 传染性 和病毒复制能力。 故本发明专利使用S蛋白上的L452R突变位点作为新型冠状病毒Delt a变 异株检测的靶基因 （NCBI， MZ571142.1） ， 本发明专利所提供的引物设计在包含L452R突变位 点的保守区域， 而特异性检测探针则设计在L 452R突变位 点上。 [0006]本发明提供的一种用于新型冠状病毒Delta变异株检测的探针， 具有S NP分型的作 用。 SNP （Single  Nucleotide  Polymorphisms） 全称为单核苷酸多态性， 是指在基因组上单 个核苷酸的变异， 变异类型包括转换、 颠换、 缺 失和插入。 SNP是人类可遗传的变异中最常见 的一种。 目前Taqman探针法荧光定量PCR检测成为最常见的SNP分型方法之一。 本发明将通 过Taqman荧光探针法验证L452R碱基由T突变成G的SNP位点， 实现L452R位点上单个碱基突 变的检测。 [0007]本发明的第一个目的是提供用于新型冠状病毒Delta变异株检测的引物探针组 合， 其特征在于， 包括 一对特异性扩增引物和一条 特异性识别单碱基突变的检测探针。说　明　书 1/10 页 3 CN 114561494 A 3