(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210303668.8 (22)申请日 2022.03.24 (71)申请人 北京淦江生物技 术有限公司 地址 101111 北京市大兴区北京经济技 术 开发区经海三路109号院4 号楼3层3 01 (72)发明人 杨尧　郭翠　纳洋　韦淑杯　 张鲁军　张伟　戴国华　王庆　 张燕娜　李旭卉　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 黄爽 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测SMN1基因突变的引物探 针及试剂盒 (57)摘要 本发明提供一种检测SMN1基因突变的引物 探针及试剂盒。 所述试剂盒包括分别检测SMN1基 因外显子7和8缺失突变的引物以及相应的突变 检测探针和封闭探针。 本发明通过降低SMN2假基 因干扰， 检测更准确可靠。 运用多重PCR扩增原 理， 使SMN1基因外显子 7和8， 内参A ctin基因三重 扩增在单个反应管内完成， 提高效率。 通过反应 体系优化， 实现微量血样免纯化基因组DNA进行 PCR扩增， 15分钟完成前处理， 整个检测约2.5小 时完成， 节约时间和纯化费用， 适合新生儿干血 斑高通量筛查检测。 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图12页 CN 115181794 A 2022.10.14 CN 115181794 A 1.检测SMN1基因外显子7和8缺失突变的引物组， 其特征在于， 所述引物组包括检测 SMN1基因外显子7缺失突变的引物对SMN1 ‑E7‑F1和SMN1 ‑E7‑R1， 以及检测SMN1基因外显子8 缺失突变的引物对SMN1 ‑E8‑F1和SMN1 ‑E8‑R1； 它们的核苷酸序列如下： SMN1‑E7‑F1： 5′ ‑TTTATTTTCCTTACAGGGTTTC‑3′； SMN1‑E7‑R1： 5′ ‑GTGAAAGTATGTTTCTTCCACGTA‑3′； SMN1‑E8‑F1： 5′ ‑CCATCTGTA AAAGACTTGG‑3′； SMN1‑E8‑R1： 5′ ‑CCACATTCAAATTTTCTCAA‑3′； 其中， 下划线处的碱基为锁核酸 修饰。 2.与权利要求1所述引物组配套使用的探针， 其特征在于， 包括突变检测探针和封闭探 针； 外显子7缺失突变对应的突变检测 探针SMN1 ‑E7‑P1： 5′ ‑FAM‑AAGAAGGAAGGTGCTCACAT ‑ MGB‑3′ 封闭探针： SMN2 ‑FB1： 5′ ‑GTTTCTTCCACACAACCAAC‑3′ 其中， 下划线处的碱基为锁核酸 修饰； 外 显 子 8 缺 失 突 变 对 应的 突 变 检 测探 针 探 针 S M N 1 ‑E 8‑P1 ： 5′ ‑C Y 5‑ CTCACCACCGTGCTGGCCTC‑MGB‑3′ 封闭探针SMN2 ‑FB2： 5′ ‑TAAAAGACTGAG GTGGGGGT‑3′。 3.SMN1基因突变 检测试剂盒， 其特 征在于， 包括前处 理液、 扩增反应液和突变 检测液； 所述前处 理液为： 2 ‑10％Chelex‑100， 0‑1％Tween‑20， 0‑20mM NaOH； 所述扩增反应液为： 1 ‑3U热启动Taq酶、 0.1 ‑0.3U/ul UNG酶、 4‑10nmol dNTP、 4‑10nmol  dUTP、 5×PCR缓冲液和扩增优化剂； 其中， 扩增优化剂为0.1 ‑0.5％BSA+0.02 ‑0.2M甜菜碱； 所述突变检测液为： SMN1 ‑E7‑F1 0.8 μM、 SMN1 ‑E7‑R1 0.8 μM、 SMN1 ‑E8‑F1 0.8 μM、 SMN1 ‑ E8‑R1 0.8 μM、 Actin ‑F 0.4μM、 Actin ‑R 0.4μM、 SMN1 ‑E7‑P1 0.4μM、 SMN1 ‑E8‑P1 0.4μM、 Actin‑P 0.4 μM、 SMN2 ‑FB1 0.16 μM和SMN2 ‑FB2 0.16 μM； 其中， SMN1 ‑E7‑F1、 SMN1‑E7‑R1、 SMN1‑E8‑F1、 SMN1‑E8‑R1、 SMN1‑E7‑P1、 SMN1‑E8‑P1、 SMN2‑FB1和SMN2 ‑FB2的定义同权利要求2中所述； Actin‑F和Actin ‑R为扩增内参基因Actin的一对引物以及检测探针Actin ‑P， 它们的核 苷酸序列如下： Actin‑F： 5′ ‑AATGAGCTGCGTGTG GCT‑3′ Actin‑R： 5′ ‑CAACACTGTCT TAGACACCTAGTC‑3′ Actin‑P： 5′ ‑HEX‑ACCCAGGTGAGTGGCCCGCTA‑BHQ1‑3′。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115181794 A 2检测SMN1基因 突变的引物探针及 试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及生物技术领域， 具体地说， 涉及一种检测SMN1基因突变的引物探针及 试剂盒。 背景技术 [0002]脊髓性肌萎缩症(SMA)， 是一类由脊髓前角运动神经元变性导致肌无力、 肌萎缩的 疾病， 由基因缺陷所导致的常染色体隐性遗传病， 临床并不少见， 发病率约为1/6000 ‑1/ 10000左右， 在人群中的携带率约为1/35 ‑1/50左右， 即50个普通人中就有一个是携带者。 一 旦夫妻双方同为携带者， 则每一胎生患儿的概率为25％， 而50％可能会携带SMA致病基因。 该病临床表现差异较大， 根据患者起病年龄和临床病程， 将SMA由重到轻分为4型。 共同特点 是脊髓前角细胞变性， 临床表现为进 行性、 对称性， 肢体近端为主的广泛性弛缓性麻痹与肌 萎缩， 智力发育及感觉均正常。 SMA患者由于脊髓运动神经元退化， 会导致全身肌肉萎缩无 力， 身体逐渐丧 失各种运动功能， 病情的发展会进而影响吞咽、 呼吸等， 最 终导致死亡,是两 岁以下婴幼儿的头号遗传病杀手， 属于罕见病里极为严重的一种。 尽早 发现并确诊， 及早干 预意义重大。 [0003]通过新生儿筛查可早期发现SMA的患儿， 在出现明显肌肉和神经系统症状前及 时 采取必要的诊疗措施， 可降低新生儿和患者的死亡率， 并有效改善患儿预后。 在国内， 58.96％的SMA患儿发病于7 ‑18月龄， 中重度患者占到了总患病人数的89 ％左右； 就运动功 能来看， 仅有2 2.78％SMA患者可以行 走。 [0004]SMN1的基因缺陷是导致脊肌萎缩症的主要原因， SMA的主要致病基因为运动神 经 元存活基因1(survival  motor neuron 1， SMN1)， 约9 0％的脊肌萎缩症患者是由SMN1基因7 号外显子纯合缺失或7号外显子和8号外显子纯合缺失所致， SMN基因位于5号染色体长臂1 区3带(5q13)上， 具有9个外显子(外显子1,2a， 2b， 3 ‑8),全长约27kb， 编码294个氨基酸的 RNA结合蛋白SMN， 这是高效组装小核内核糖核蛋白(snRNP)复合物所必需的。 其有2个高度 同源拷贝SMN1和SMN2基因， 端粒侧称SMN1， 着丝粒侧称SMN2。 两者仅在各 自的3’端有5个碱 基的差别， 其中2个碱基位于 外显子7、 8， 另3个碱基在内含子 6、 7中。 [0005]因此， 检测SMN1基因外显子7拷贝数， 对SMA的临床诊断以及正常人群携带者筛查 具有重要意 义， 特别是针对新 生儿进行早期 SMA筛查， 将防控关卡迁移， 提高防控效果。 [0006]目前临床上用于SMA基因检测方法主要有： 限制性片段长度多态性聚合酶链式反 应技术(PCR ‑RFLP)、 变性高效液相色谱分析(PCR ‑DHPLC)、 多重连接探针扩增技术(MLPA)、 实时荧光定量PCR、 高通量测序等。 PCR ‑RFLP法只能检测SMN1基因7号外显子纯合缺失， 不能 检测单拷贝缺失的携带者。 PCR ‑DHPLC法、 MLPA法和高通量测序可用于检测纯合缺失型患者 以及杂合 缺失型携带者， 但操作复杂、 通 量低、 耗时长、 需特定的仪器、 且价格 较贵。 [0007]目前已有的实时荧光定量PCR技术检测SMN1基因外显子7和8， 主要是针对SMN1特 异位点设计阻滞引物或者探针， 但一般的阻滞引物仍然不能排除假基因SMN2的非特异扩 增， 导致非特异结果。说　明　书 1/8 页 3 CN 115181794 A 3