(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210300581.5 (22)申请日 2022.03.24 (71)申请人 杭州时轮医药 科技有限公司 地址 311231 浙江省杭州市萧 山科技城传 化科创大厦1幢3楼3 06室 (72)发明人 李旦　史金阳　郑炜　万建峰　 (74)专利代理 机构 杭州华知专利事务所(普通 合伙) 33235 专利代理师 束晓前 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于异种移植供体猪多重病毒实时荧 光检测的特异性引物、 探 针和试剂盒 (57)摘要 本发明公开了一种用于异种移植供体猪多 重病毒实时荧光检测的特异性引物、 探针和试剂 盒， 通过对猪内源性反转录病毒(PERV)， 猪流感 病毒(SI)以及猪戊肝病毒(PHEV)的核酸序列进 行比对分析， 分别以PERV ‑GAG基因1332 ‑1430区 段(三型PERV ‑ABC均高度保守)， SI ‑HA基因, PHEV‑ORF3基因为扩增靶位点， 选择无二级结构 且高度保守的区段， 根据引物探针 设计的基本原 则， 利用引物分析软件和人工判断， 并经多次实 验优化后确定适合实时荧光定量Real  Time‑PCR (RT‑PCR或qPCR)的多对引物和探针。 本发明还公 开了对应的快速筛查和定量检测的试剂盒及方 法。 本发明提供同时筛查供体猪内源性反转录病 毒(PERV)， 猪流感病毒(SI)以及猪戊肝病毒 (PHEV)的方法。 权利要求书3页 说明书6页 附图1页 CN 114672592 A 2022.06.28 CN 114672592 A 1.一种用于异种移植供体猪多重病 毒实时荧光检测的特异性引物、 探针， 其特征在于， 通过对已报导PERV,SI,PHEV的核酸序列进行比对分析， 分别以PERV ‑GAG基因1332 ‑1430区 段(三型PERV ‑ABC均高度保守)， SI ‑HA基因,PHEV ‑ORF3基因为扩增靶位点， 选择无二级结构 且高度保守的区段， 根据引物探针设计的基本原则， 利用引物分析软件和人工判断， 并经多 次实验优化后确定适 合实时荧 光定量Real  Time‑PCR(RT‑PCR或qPCR)的多对引物和探针。 2.根据权利要求1所述的用于异种移植供体猪多重病毒实时荧光检测的特异性引物、 探针， 其特 征在于， 所述PERV病毒正反向引物及探针序列分别是： 正向引物： 5' ‑tgatcaggatgagagccgg‑3'， 反向引物： 5' ‑ttaaaccatggctaataaaccaaga‑3'， Probe： 5' ‑FAM‑tgccaaatcttgccacgtaaggatataggg BHQ‑3'， 所述SI病毒正反向引物及探针序列分别是： 正向引物： 5' ‑gggaatatctca aacctttcaaatg‑3'， 反向引物： 5' ‑acaaaggtgtaacggcagcat‑3'， Probe： 5' ‑Fam‑cgagtcatgattgggccatgaacttgt‑3'， 所述PHEV病毒正反向引物及探针序列分别是： 正向引物： 5' ‑gtcaccccagaaaccacc‑3'， 反向引物： 5' ‑ttcatccaaccaacccct‑3'， Probe： 5' ‑Fam‑gcgaagggctgagaatca‑BHQ1‑3'， 上述三对荧光探针分别在5'端标记有荧 光报告基团， 3'端标记有荧 光淬灭基团。 3.根据权利要求2所述的用于异种移植供体猪多重病毒实时荧光检测的特异性引物、 探针， 其特征在于， 所述荧光报告基团为FAM； 所述荧光淬灭基团为BHQ。 也可以根据特殊的 荧光报告基团选择相对应的荧光淬灭基团进 行不同方式的多种组合， 以适应众多厂家多通 道荧光PCR仪器的不同需求。 如荧光报告基团可以选择FA M、 VIC、 CY3、 ROX、 CY5、 TET、 HE X、 JOE 等； 淬灭基团选择与荧 光基团相对应的淬灭基团如 BHQ系列、 TAMRA、 DABC YL等。 4.一种用于异种移植供体猪多重病毒实时荧光检测的特异性试剂盒， 其特征在于， 试 剂盒包括PERV,SI,PHEV反应混合液、 RNA人工 内标(BIOLINE  BIO38041)、 阳性质控 品、 阴性 质控品， 所述反应 混合液含有内标探针和如权利要求 1至3任一所述的荧光RT ‑PCR引物和荧 光探针。 5.根据权利要求4所述的一种用于异种移植供体猪多重病 毒实时荧光检测的特异性试 剂盒， 其特征在于， 1)所述PERV反应混合液由与PERV ‑ABC型靶多核苷 酸结合的正向引物， 反 向引物， 和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别 结合有荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭 基团的寡核苷 酸探针组成， 另外还有RT ‑PCR反应需要的逆转录 混合液及人工内标扩增反应 (特异探针报告基团为Cy5)混合液； 2)所述SI混合液和3)HEV混合液分别由与SI和HEV靶多 核苷酸结合的正向引物， 反向引物， 和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光 报告基团(均为FAM)和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针组成， 另外还有RT ‑PCR反应需要的逆 转录混合液。 6.根据权利要求5所述的一种用于异种移植供体猪多重病 毒实时荧光检测的特异性试 剂盒， 其中阴性质控品为去离 子水， 阳性质控品为含有病毒特异序列的合成DNA。权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 114672592 A 27.一种用于异种移植供体猪多重病毒实时荧光检测的方法， 其特征在于， 试剂组成如 下： 1)PERV— —ABC型和人工内标反应混合液(5 0ul/管)1管 2)SI反应混合液1管； 3)HEV反应混合液1管； 4)阴性质控品(20 0ul/管)1管； 5)阳性质控品(PERV， SI， H EV)各1管； 6)RNA人工内标(BIOL INE BIO38041)1管： 所述RNA人工内标不会干扰靶序列扩增的人工合成的内标， 在核酸提取开始前加入每 个标本和阴性质控中， 完成与模板同时提取和 一起扩增的每个步骤， 监控样本提取和扩增 中出现的任何抑制因子， 确保 反应过程的有效性。 其中1)反应混合液由与PERV  ABC型靶多核苷酸结合的正向引物， 反向引物， 和能够与 靶多核苷 酸结合并且两末端分别结合有荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团的寡核苷 酸探 针组成， 另外还有RT ‑PCR反应需要的逆转录混合液及人工内标扩增反应(特异探针报告基 团为Cy5)混合液； 2)和3)混合液分别由与SI和HEV靶多核苷酸的结合的正向引物， 反向引 物， 和能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光报告基团(均为FAM)和荧光淬灭 基团的寡核苷酸探针组成， 另外还有RT ‑PCR反应需要的逆转录混合液。 其中阴性质控品为去离 子水， 阳性质控品为含有病毒特异序列的合成DNA。 8.根据权利要求7所述的一种用于异种移植供体猪多重病毒实时荧光检测的方法， 其 特征在于， 包括以下步骤： (l)RNA提取： 使用MagNA  Pure LC和罗氏MagNA核酸提取纯化试剂盒(Roche  Cat N)； 05323738001)， 在推荐的操作程序下， 可提取高纯度的RNA。 RNA内部提取参照(IEC： BI OLINE  BIO38041)提取 前加入标本中作为质量 监控； (2)RT‑PCR反应： 按表1配方做反应混合液： 表1.反应混合液配方(ul) 反应混合物(ul) PERV+人工内标 SI HEV 混和液 15 15 15 RNA模板 10 10 10 总计 25 25 25 按表2方式安排96孔扩增板： 表2.96孔扩增板权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 114672592 A 3