(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210321308.0 (22)申请日 2022.03.24 (71)申请人 复旦大学附属中山医院 地址 200032 上海市徐汇区医学院路13 6号 申请人 复旦大学附属华 山医院 (72)发明人 徐勤霞　邱晓燕　张明　钟明康　 (74)专利代理 机构 上海申新 律师事务所 31272 专利代理师 郎祺 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 检测TLR10 rs28393318基因型的方法及其 在评估长期移植肾功能中的应用 (57)摘要 本发明提供了一种检测T LR10rs2839 3318基 因型的方法及其在评估肾移植受试者长期移植 肾功能中的应用。 TLR10rs28393318的基因型可 用于预测肾移植患者长期移植肾功能， 从而可用 于指导临床治疗以提高移植肾的长期存活率， 所 以本发明提供的检测T LR10rs2839 3318基因型的 方法可以提高对肾移植受试者长期移植 肾功能 的预测敏感度， 为制备相应的预测或评估产品提 供策略， 具有很大的社会效益及经济效益。 权利要求书1页 说明书8页 序列表1页 附图2页 CN 115505633 A 2022.12.23 CN 115505633 A 1.一种检测TLR 10 rs28393318基因型的方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： 步骤一， 提取受试者全血基因 组DNA， 调整浓度后进行PCR扩增； 步骤二， 扩增的PCR产物经SAP处 理后， 进行 单碱基延伸反应； 步骤三， 纯化单碱基延伸反应产物， 用飞行时间质谱仪进行检测， 进行基因分型。 2.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 所述基因组DNA的浓度被调整为20 ‑50ng/ μ l。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤一中PCR扩增所采用的引物的序列为 SEQ ID No.： 1和SEQ  D No.： 2。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤二中单碱基延伸反应所采用的单碱基 延伸引物的序列为SEQ  ID No.： 3。 5.如权利要求1 ‑4任一项所述方法采用的试剂在制备用于评估肾移植受试者长期移植 肾功能的产品中的应用， 其特 征在于， 包括所述方法采用的试剂以及使用说明书。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特 征在于， 所述使用说明书包括如下指示： a.采用所述方法检测TLR 10 rs28393318基因型； b.基于分型检测结果根据评估标准对受试者肾功能进行评估； 所述分型检测结果选自 AA型、 AG型和GG型中的一种； 所述评估标准为： 携带AA/AG型的受试者肾移植后肾功能的下 降较携带G G型的受试者更 快， 肾功能损伤的风险更 大。 7.如权利要求1 ‑4任一项所述方法采用的试剂在制备用于评价受试者是否 需要重点监 测肾脏病理变化的产品中的应用， 其特 征在于， 包括所述方法采用的试剂以及使用说明书。 8.根据权利要求7 所述的应用， 其特 征在于， 所述使用说明书包括如下指示： a.采用所述方法检测TLR 10 rs28393318基因型； b.基于分型检测结果根据评价标准对受试者是否需要重点监测肾脏病理变化进行评 价； 所述分型检测结果选自AA型、 AG型和GG型中的一种； 所述评价标准为： 携带AA/AG型的受 试者需要重点监测肾脏病理变化， 调整治疗方案； 携带GG型的受试者不需要重点监测肾脏 病理变化， 调整 治疗方案 。 9.一种用于评估肾移植受试者长期移植肾功能以及评价受试者是否需要重点监测肾 脏病理变化的试剂盒， 其特征在于， 包括如权利要求1 ‑4任一项所述方法所采用的试剂， 优 选包括序列为SEQ  ID No.： 1～SEQ  ID No.： 3的引物。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115505633 A 2检测TLR10  rs28393318基因型的方 法及其在评估长期移 植肾 功能中的应用 技术领域 [0001]本发明涉及基因检测技术领域， 具体涉及一种检测TLR10  rs28393318基因型的方 法及其在评估长期移植肾功能中的应用。 背景技术 [0002]肾脏移植作为最早开展的器官移植术之一， 是终末期肾脏病的一种非常有效的治 疗方法。 随着移植器官获取保存的规范化、 移植手术的日臻成熟和新型免疫抑制剂的广泛 应用， 移植肾的存活率日渐提高， 存活时间也不断延长， 移 植患者的身体健康与生活质量 都 得到了极大的改善， 肾脏移 植成为了除腹膜透析和血液透析外终末期肾脏病患者的最佳选 择。 但移植肾脏的长期存活仍是肾脏移植面临的一个重大问题， 而移植后肾功能的持续下 降与移植 肾的存活密切相关。 肾小球滤过率(Estimate  glomerular  filtration  rate， eGFR)是评价肾功能的最好的指标， eGFR随时间的变化是评估移植后肾功能进程的推荐手 段。 肾移植患者需要长期使用免疫抑制剂来降低移 植排斥， 以提高移 植肾的存活率。 而免疫 抑制剂作用不足可能增加 排斥反应的风险， 过强有可能引起不良反应的发生， 包括肾毒性 等， 这些因素都会影响移植后eGFR的变化， 使得移植后肾功能在个 体间具有很大的差异。 [0003]遗传因素是造成移植肾功能的个体差异的重要因素之一， 而单核苷酸多态性 (Single nucleotide  polymorphisms， SNP)是最常见的遗传变异形式， 90％的个体差异是 由SNP造成的。 [0004]Toll样受体(Toll ‑like receptors， TLRs)是参与天然免疫的一类重要蛋白质分 子， 是微生物入侵后预警免疫系统必需的天然免疫受体， 在机体抗感染免疫激活机体天然 免疫中发挥重要作用。 并且TLRs通过调控 单核/巨噬细胞、 树突状细胞等抗原 提呈细胞的活 化， CD80等第二信号的表达， 在天然免疫和获得性免疫之间起着重要的桥梁作用。 此外， 新 近的研究表明， TLRs还参与某些自身免疫性疾病及机体的移植免疫， 动物实验和临床研究 也报道了TL Rs与同种异体排斥反应程度相关联， 其过度的免疫应答反应可以引发移 植物排 斥反应。 因此TLRs信号 通路参与移植免疫的研究已成为器官移植领域研究的热点之一。 [0005]目前， 在哺乳动物及人类中已经发现的人TLRs家族成员有13种， 即TLR1 ‑TLR13。 其 分布十分广泛， 主要分布于单核细胞、 巨噬细胞、 树突状细胞、 多 形核细胞、 B细胞、 T细胞、 嗜 碱性粒细胞及NK细胞等淋巴细胞。 TLR10是TLRs家族的一个重要成员， 主要表达在免疫相关 的组织和细胞， 包括脾、 淋巴结、 人类B细胞等。 不同于其他TLRs家族成员， TLR10具有抑炎作 用， 对其他TLR信号、 炎症因子的产生、 单核细胞和B 细胞的活化具有抑制作用。 [0006]已有文献研究报道了TLR10可能与一些肿瘤、 免疫疾病和感染疾病相关， 如膀胱 癌、 IgA肾病、 克罗恩病、 哮喘、 肺曲霉菌病， 关节炎等等。 也有在同种异体造血干细胞移 植患 者中的研究中发现TLR10与急性移植物抗宿 主疾病的发病相关。 TLR10基因多态性与许多免 疫性疾病的发病密切相关， 而且TLRs与器官移 植免疫的相关性已经得到公认， TL R10基因多 态性对于 评估肾移植患者长期移植肾功能具有重要意 义。说　明　书 1/8 页 3 CN 115505633 A 3