(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210298777.5 (22)申请日 2022.03.24 (71)申请人 安徽医科 大学 地址 230000 安徽省合肥市蜀山区梅 山路 81号 (72)发明人 都建　吴敏敏　蔡海建　安然　 陈滢　周南　 (74)专利代理 机构 合肥市浩智运专利代理事务 所(普通合伙) 34124 专利代理师 叶濛濛 (51)Int.Cl. A61K 39/002(2006.01) C12N 15/79(2006.01) C12N 15/87(2006.01) C12N 15/113(2010.01)C12N 15/55(2006.01) C12N 1/11(2006.01) C12N 1/36(2006.01) C12Q 1/6893(2018.01) C12N 15/11(2006.01) A61P 33/02(2006.01) C12R 1/90(2006.01) (54)发明名称 一种预防弓形虫病的ME49Δcdpk3减毒活疫 苗及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明涉及弓形虫疫苗技术领域， 具体来说 是一种用于 预防弓形虫病的ME49 Δcdpk3减毒活 疫苗， 减毒活疫苗是通过CRISPR/Cas9介导的基 因编辑技术在ME49上敲除CDPK3构建的ME49Δ cdpk3虫株， 减毒活疫的制备步骤包括(1)构建靶 向Cas9质粒、 (2)构建同源供体DNA、 (3)构建ME49 Δcdpk3的混合克隆虫株和(4)筛选获得ME49Δ cdpk3单克隆虫株。 在本申请中使用ME49Δcdpk3 的速殖子免疫BALB/c小鼠， 通过小鼠模型评估 ME49Δcdpk3减毒株作为疫苗的保护性免疫， 研 究发现ME49 Δcdpk3免疫引起的免疫反应可以保 护小鼠免受急性和潜伏弓形虫感染， 表明ME49 Δ cdpk3的速殖子可以提供对不同寄生虫菌株的有 效保护， 因此ME49Δcdpk3可被用作对抗弓形虫 的潜在候选疫苗。 权利要求书2页 说明书10页 附图4页 CN 114569711 A 2022.06.03 CN 114569711 A 1.一种用于预防弓形虫病的ME49Δcdpk3减毒 活疫苗， 其特征在于： 所述减毒活疫是通 过CRISPR/Cas9介导的基因 组编辑技术在ME49虫株敲除CD PK3构建的M E49Δcdpk3虫株。 2.如权利 要求1所述的一种用于预防弓形虫病的ME49Δcdpk3减毒活疫苗的制备方法， 其特征在于： 包括以下 具体步骤： (1)构建靶向Cas9质粒 敲除弓形虫CRISPR/Cas9的质粒pSAG1::Cas9 ‑U6::sgUPRT， 使用E ‑CRISPR软件进行靶 点设计， 使用 定点突变试剂盒将质粒pSAG1::Cas9 ‑U6::sgUPRT中的sgRNA替换为靶向 CDPK3的sgRNA， 即构建质粒pSAG1: :Cas9‑U6::sgCDPK3； (2)构建同源供体DNA 将从II型ME49菌株的基因组DNA中扩增CDPK3  5'‑和3'‑同源臂片段， 以及从pUPRT ‑ DHFR中扩增DHFR ‑TS序列； 使用多片段一步快速克隆试剂盒将三片段通过同源重组克隆到 pUC19线性 化载体之间， 构建三片段的供体DNA质粒； (3)构建M E49Δcdpk3的虫株 将步骤(1)构建的质粒pSAG1::Cas9 ‑U6::sgCDPK3和 步骤(2)构建的供体DNA片段电穿 孔转染到纯化的M E49速殖子中， 并用乙胺嘧啶筛 选， 制备得到ME49Δcdpk3的混合克隆； (4)筛选获得ME49Δcdpk3单克隆虫株 通过倍比稀释将单个弓形虫接种到铺有人包皮成纤维细胞(HFF细胞)的96孔板中； 7 ‑ 10天后通过PCR和免疫印迹检测阳性克隆， 获得 单个克隆的虫株。 3.根据权利 要求1所述的一种用于预防弓形虫病的ME49Δcdpk3减毒 活疫苗， 其特征在 于： 所述步骤(1)中质粒pSAG1: :Cas9‑U6::sgUPRT的引物为： CDPK3‑gRNA‑F： TGTACCGAGGGTTTTAGAGCTAGA AATAGC； CDPK3‑gRNA‑R： CCTCCATGACAACTTGACATCCCCATTTAC。 4.根据权利 要求1所述的一种用于预防弓形虫病的ME49Δcdpk3减毒 活疫苗， 其特征在 于： 所述步骤(2)中DHFR ‑TS的引物为： DHFR‑TS‑F： TGTCAT TCGATTTTCACCCCC； DHFR‑TS‑R： AGTGTGATGACTC CGCAACT GGATCGATC CCCCCGGGCTGC。 5.根据权利 要求1所述的一种用于预防弓形虫病的ME49Δcdpk3减毒 活疫苗， 其特征在 于： 所述步骤(4)中诊断性PCR包括PCR 1、 PCR2和PCR3 。 所述PCR1的引物为： PCR1‑F： GCCTAACAAGGATTCGATCAGTAGC； PCR1‑R： TGTCGTG GATTTACCAGTCATG GAC； 所述PCR2的引物为： PCR2‑F： TGACTCT TCATGTGGCATTTCACAC； PCR2‑R： TACTGTGT TAGGTAGCAAATGTGG； 所述PCR3的引物为： PCR3‑F： TCGTGCGTCT TCAGGCATGTACATC； PCR3‑R： GAGGTCCTTTCGCTTCCTGAGACTC 。 6.根据权利 要求1所述的一种用于预防弓形虫病的ME49Δcdpk3减毒 活疫苗， 其特征在权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114569711 A 2于： 所述M E49Δcdpk3速殖子的免疫剂量103～106个。 7.根据权利 要求6所述的一种用于预防弓形虫病的ME49Δcdpk3减毒 活疫苗， 其特征在 于： 所述M E49Δcdpk3速殖子的免疫剂量 为103个。 8.如权利要求1所述的一种用于预防弓形虫病的ME49Δcdpk3减毒活疫苗在预防寄生 虫感染中的应用。 9.如权利要求1所述的一种用于预防弓形虫病的ME49Δcdpk3减毒活疫苗在预防弓形 虫慢性感染中的应用。 10.如权利 要求1所述的一种用于预防弓形虫病的ME49Δcdpk3减毒活疫苗在预防多种 弓形虫急性感染中的应用。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114569711 A 3