(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210292620.1 (22)申请日 2022.03.24 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114381538 A (43)申请公布日 2022.04.22 (73)专利权人 中国疾病预防控制中心传染病预 防控制所 地址 102206 北京市昌平区昌百路15 5号 (72)发明人 李振军　邱小彤　徐帅　 (74)专利代理 机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 专利代理师 黄爽 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12Q 1/6804(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/365(2006.01) 审查员 张丽华 (54)发明名称 用于检测鼻疽诺卡菌的LAMP引物组和检测 试剂盒 (57)摘要 本发明提供一种用于检测鼻疽诺卡菌的 LAMP引物组和检测试剂盒。 本发明以 pbr1基因作 为鼻疽诺卡菌的目标检测基因， 设计并合成LAMP 引物， 将LAMP扩增技术和CRISPR ‑Cas12a检测技 术联合用于鼻疽诺卡菌的检测， 通过在引物FIP 或BIP的连接区插入PA M位点序列TTTA， 使本方法 不受PAM位点的限制。 本发明提供的检测方法仅 需简单的恒温金属浴或水浴， 以及便携式荧光读 取仪或一次性便携式试纸条即可完成检测， 无需 复杂的精密仪 器， 尤其适合现场和床旁检测。 权利要求书2页 说明书11页 序列表3页 附图8页 CN 114381538 B 2022.06.21 CN 114381538 B 1.用于检测鼻疽诺卡菌的LAMP引物组， 其特 征在于， 所述 LAMP引物组为： 外侧正向引物F3： 5 ’ ‑  GCGGTGAGCAGTGACGT   ‑3’； 外侧反向引物B3： 5 ’ ‑  ACCCGGCACCAGGAGT  ‑3’； 内侧正向引物FIP： 5 ’ ‑  CCATGTCGTAG GCGACCAGCTCGC CACCATGCGGAAAC  ‑3’； 内侧反向引物BIP： 5 ’ ‑  AGTGTGCGCGACGA ACAACCGGCGCCATGGTGGGGTT  ‑3’； 环引物LF： 5 ’ ‑  GAGACCGCGTTGTCCCC  ‑3’； 环引物LB： 5 ’ ‑  ACGCTGACGATG GCACT  ‑3’。 2.基于CRISPR ‑Cas12a技术的鼻疽诺卡菌核酸检测试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包 含权利要求1所述的LAMP引物组、 crRNA、 Cas12a蛋白、 荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单 链DNA探针； 且在LAMP引物组的引物FIP或BIP中引入PAM位 点； 或者， 所述试剂盒包含权利要求1所述的LAMP引物组、 crRNA、 Cas12a蛋白、 荧光基团和生物素 双标记的单链DNA探针； 且在LAMP引物组的引物FIP或BIP中引入PAM位 点； 其中， crRNA的序列为： 5 ’ ‑  UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU UCGCCACCAUGCGGAAACGGCU  ‑3’； 单链DNA探针的序列为： 5 ’ ‑  TTTATTTATTT  ‑3’。 3.根据权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 引入PAM位点的引物FIP的核苷酸序列 为： 5’ ‑  CCATGTCGTAG GCGACCAGCTCGC CACCATGCGGAAAC‑3’。 4.根据权利要求2或3所述的试剂盒， 其特征在于， 在单链DNA探针的5 ’端修饰6‑FAM或 FITC基团， 3 ’端修饰BHQ1； 或者， 在单链DNA探针的5 ’端修饰6‑FAM或FITC基团， 3 ’端修饰生物素。 5.基于CRISPR ‑Cas12a技术的鼻疽诺卡菌核酸检测方法， 其特征在于， 所述方法为非疾 病诊断目的， 包括以下步骤： 1） 提取待测样品中的DNA； 2） 以步骤1） 中提取的DNA为模板， 利用权利要求2 ‑4任一项所述试剂盒中的LAMP引物组 进行LAMP扩增反应； 3） 将步骤2） 的扩增产物与反应缓冲液、 crRNA和Cas12a蛋白形成的复合物以及荧光基 团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针混合， 反应一段时间后进行荧 光强度检测。 6.基于CRISPR ‑Cas12a和侧流层析技术的鼻疽诺卡菌核酸检测方法， 所述方法为非疾 病诊断目的， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1） 提取待测样品中的DNA； 2） 以步骤1） 中提取的DNA为模板， 利用权利要求2 ‑4任一项所述试剂盒中的LAMP引物组 进行LAMP扩增反应； 3） 将步骤2） 的扩增产物与反应缓冲液、 crRNA和Cas12a蛋白形成的复合物以及荧光基 团和生物素双标记的单链DNA探针混合， 反应一段时间后， 将反应产 物加到侧流层析检测试 纸条上， 并滴加2~3滴运行缓冲液， 使反应产物在毛细管作用下沿试纸条流动， 2分钟内观 察 显色结果。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述侧流层析检测试纸条由样品垫、 结合 垫、 硝酸纤维素膜和吸 收垫组成； 其中， 结合垫包被有链霉亲和素修饰的纳米金颗粒； 硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线， 检测线包被有生物素化牛血清白蛋白， 质控线权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114381538 B 2包被有抗 羧基荧光素抗体或抗异硫氰酸 荧光素抗体。 8.根据权利 要求5‑7任一项所述的方法， 其特征在于， 步骤2） LAMP扩增反应的反应体系 按25 μL计包含： 12.5 μL  2×等温扩增缓冲液， 1μL  8000 U/mL Bst 2.0， 0.4 μM引物F3和B3， 0.8 μM引物LF和LB， 1.6 μM引物FIP和BIP， 1μL  DNA模板， 用无DNA酶和RNA酶的去离子水补齐 至25 μL； LAMP扩增反应条件： 70℃反应40分钟。 9.根据权利要求5 ‑7任一项所述的方法， 其特征在于， 步骤3） 包括： 将扩增产物与反应 缓冲液、 crRNA和Cas12a蛋白形成的复合物以及荧光基团和生物素双标记的单链DNA探针 混 合， 于37℃反应8分钟。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114381538 B 3